牛SPAG11D基因的原核表达及其抑菌活性研究

  • 投稿Adam
  • 更新时间2015-09-22
  • 阅读量264次
  • 评分4
  • 13
  • 0

胡修忠,凌明湖,王定发,程 蕾,向 敏,刘晓华,夏 瑜

(武汉市畜牧兽医科学研究所,武汉 430208)

摘要:为了检测重组蛋白SPAG11D的抑菌活性,提取牛睾丸组织总RNA,经RT-PCR扩增了SPAG11D基因,将该基因插入pET-32a(+)融合表达载体,并转入BL21(D3)进行原核表达,通过改变IPTG浓度和诱导时间优化表达条件,并用琼脂扩散法测定重组蛋白体外抑菌活性。结果显示,成功扩增牛SPAG11D基因,产物大小为390 bp,其序列与GenBank公布序列相一致;正确构建了原核表达载体pET-32a(+)-SPAG11D,重组蛋白最佳表达条件为IPTG终浓度1.0 mmol /L、诱导时间为4 h;表达产物的分子质量约为33 kDa;该重组蛋白对霍乱弧菌具有明显的体外抑菌活性。本研究成功构建了牛SPAG11D基因的原核表达载体,并获得了具有抑菌活性的重组蛋白His-SPAG11D。

教育期刊网 http://www.jyqkw.com
关键词 :牛;原核表达;SPAG11D基因;抑菌作用

中图分类号:S823文献标识码:A文章编号:0439-8114(2015)05-1135-04

DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.027

收稿日期:2014-12-16

基金项目:武汉市农业科学技术研究院创新基金项目(CX201245)

作者简介:胡修忠(1980-),男,山东曹县人,畜牧师,主要从事动物遗传育种与繁殖工作,(电话)027-81776323(电子信箱)hu_xiu_zhong@126.com。

精子相关抗原11(Sperm associated antigen 11,SPAG11)是精子膜上的一种蛋白,也是β防御素的一种,由2个相互独立的β防御素基因通过通读转录连接到一起[1],主要在哺乳动物的睾丸、附睾和雄性生殖道中表达。SPAG11被认为在雄性生殖道的先天免疫、精子的成熟以及透明带的识别和精卵结合等事件中起到重要的作用[2-4]。

雄性生殖系统的病原感染严重威胁其生殖和内分泌功能,如沙眼衣原体可以引起附睾炎并阻碍附睾内精子的运动[5]。而SPAG 11蛋白能够抵御病原微生物对机体生殖道的侵害。对人的SPAG11各蛋白亚型研究表明,其N-端都具有抗菌活性,而且人的SPAG11C蛋白抗大肠杆菌活性远大于该亚型N-端的抗菌活性[6,7]。此外还发现,猕猴的SPAG11蛋白也具有抗菌活性。

目前认为SPAG 11在精子通过附睾的过程中参与精子的成熟。Zhou等[4]发现大鼠附睾头部的SPAG11E蛋白结合在精子的头部,在附睾尾部的蛋白结合在精子顶体后部,这表明SPAG11E蛋白在精子通过附睾时对精子起一定的修饰作用,此外SPAG11E蛋白能够提高未成熟精子的运动能力。

在牛体内共发现6种SPAG11蛋白亚型:SPAG11C、SPAG11D、SPAG11E、SPAG11U、SPAG11V、SPAG11W[8],它们存在于睾丸、附睾、输精管上皮以及非生殖道组织中。余树民等[9]在牦牛生殖器官中也检测到了这6个亚型的表达。

1 材料与方法

1.1 试剂

Trizol试剂购自Invitrogen公司;cDNA反转录试剂盒、TaqDNA聚合酶、Hind III和 BamH I限制性内切酶均购自TaKaRa公司;T4 DNA连接酶购于Biolabs公司;EasyPure Plasmid MiniPrep Kit质粒快速提取试剂盒、EasyPure Quick Gel Extraction Kit琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司;TEMED购自Amresco公司;异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)购自Merck公司;氨苄青霉素(Amp)购自Sigma公司;丙烯酰胺、过硫酸铵、乙二胺四乙酸(EDTA)、十二烷基硫酸钠(SDS)等均为国产分析纯试剂。

1.2 菌种和质粒

E. coli DH5α、BL21(DE3)购自北京全式金生物技术有限公司;pET-32a(+)、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌O139、大肠杆菌O157、大肠杆菌K88、大肠杆菌K199和沙门氏菌为本实验室保存。

1.3 试验动物

刚出生的小公牛。

1.4 引物设计

根据GenBank上公布的牛抗精子抗体SPAG11D(KC899318.1)基因的核苷酸序列设计特异引物:P1: 5′-CGGGATCCATGAAGCAATTCCTCGC -3′,P2:5′-CCCAAGCTTCTAGGTGCCTGATCTG-3′

1.5 SPAG11D基因的克隆和测序

取小公牛睾丸和附睾组织,于液氮中保存。RNA提取参照文献[10]的方法提取组织的总RNA,以Olig(dT)为引物反转录生成第1链cDNA。以P1、P2为引物扩增SPAG11D基因。反应体系(20 μL)如下:ddH2O 7.4 μL,模板2 μL,P1和P2 (10 pmol/L)各0.3 μL,TaqDNA聚合酶10 μL。反应条件如下:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,30个循环;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。PCR产物于1%琼脂糖凝胶中电泳检测。

用DNA凝胶回收试剂盒回收SPAG11D基因的PCR产物,连接于克隆载体PUC57,构建 PUC57-SPAG11D质粒并转化DH 5α感受态细胞,提取重组质粒,经双酶切鉴定后送上海生工生物工程有限公司测序。

1.6 原核表达载体的构建

用Hind III和BamH I 双酶切PUC57-SPAG11D,再克隆到原核表达载体pET-32a(+)的Hind III和BamH I位点之间,构建重组表达质粒pET-32a(+)-SPAG11D,转化DH5α感受态细胞,经双酶切鉴定筛选得到阳性克隆。

1.7 重组蛋白的诱导表达及表达条件的优化

将鉴定好的重组质粒和空载体质粒pET-32a(+)分别转化到E. coli BL21(DE3)感受态细胞中。挑取单菌落,接种到3 mL含Amp的LB液体培养基中,37 ℃振荡培养过夜。取活化后的菌液0.l mL加入到10 mL LB液体培养基中,37 ℃、 200 r/min振荡培养2~3 h,当菌液OD600 nm为0.6~0.8时,加入IPTG至终浓度1.5 mmol/L,继续振荡培养,分别取1 mL诱导0、3、4和5 h的菌液,12 000 r/min离心2 min,收集菌体,加入40 μL灭菌ddH2O,再加入等体积2×SDS加样缓冲液,混匀,煮沸5~10 min,SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的表达情况。

分别用不同的IPTG剂量(终浓度为1.0、1.5、2.0 mmol/L) 和诱导时间(3、4、5 h)进行表达条件的优化。优化表达条件后,进行15% SDS-PAGE分离,经考马斯亮蓝染色、数次脱色后拍照观察结果。

1.8 抑菌活性测定

收集诱导表达的细菌,压力破碎后离心收集上清液。利用琼脂扩散法检测重组蛋白的体外抑菌活性:金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌O139、大肠杆菌O157、大肠杆菌K88、大肠杆菌K199和沙门氏菌于LB液体培养基中,37 ℃摇床振荡培养12 h。调整菌液浓度为108 CFU/mL;再将菌液稀释适当倍数。将稀释后的菌液均匀涂布于平板上。待琼脂表面水分干燥后,用镊子将无菌的牛津杯轻轻放入培养皿中,吸取上清液0.16 mL至牛津杯中。平皿放置4 ℃冰箱扩散8 h,转入37 ℃温箱中10~12 h后观察并测定抑菌圈的大小。

2 结果与分析

2.1 SPAG11D基因的PCR扩增

SPAG11D基因的PCR的产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测,显示大小约 390 bp左右的片段,与预计的片段大小相符(图1)。

2.2 克隆载体的构建及鉴定

将SPAG11D基因的PCR产物连接于克隆载体PUC57,转化大肠杆菌DH5α,经双酶切鉴定后测序。双酶切结果如图2所示,测序结果与GenBank上发表的序列相一致。

2.3 表达载体的双酶切鉴定

经测序鉴定正确的克隆载体经Hind III和BamH I双酶切,克隆至原核表达载体pET-32a(+)上,构建表达载体pET-32a(+)-SPAG11D,转化DH5α感受态细胞,经双酶切鉴定筛选得到阳性克隆(图3)。

2.4 原核表达产物的检测及条件优化

将含有质粒pET-32a(+)-SPAG11D阳性克隆菌分别在37 ℃条件下经IPTG诱导后,用15% SDS-PAGE对表达产物进行分析。诱导后在33kDa左右处有一明显蛋白带,与预期的大小相符,而未诱导菌没有同样大小的特征带,说明目的基因成功表达(图4、图5)。诱导最佳时间为4 h,诱导最佳IPTG浓度为1.0 mmol/L。

2.5 重组蛋白抑菌活性测定

检测了表达的重组蛋白在体外对霍乱弧菌O139、大肠杆菌K199、K88、O157、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的体外抑菌性。结果显示,重组蛋白对霍乱弧菌的生长有抑制作用(图6)。

3 讨论

睾丸、附睾和精囊等生殖道的感染严重威胁雄性的生殖和内分泌功能[2]。泌尿生殖道微生物大多数为表皮葡萄球菌和棒状杆菌,少数为革兰阴性杆菌、大肠杆菌、支原体、衣原体等[11]。其中大肠杆菌可引起40%~70%的精子活动凝聚,使精子活力下降,从而影响生育[12]。防御素是存在于哺乳类动物体中的抗微生物肽,在天然免疫过程中起到重要的作用,而且对机体无毒副作用。SPAG11蛋白是β防御素的一种,对人、猴的研究表明一些SPAG11蛋白亚型对大肠杆菌、奈瑟菌、肠球菌和葡球菌具有很好的杀伤能力。本研究表达的融合蛋白对霍乱弧菌具有明显的生长抑制现象,表明牛SPAG11D蛋白具有抗菌活性,与其他物种具有类似的抗菌功能。牛SPAG11D蛋白可能在抵御病原菌侵害雄性生殖道方面发挥重要的作用。

SPAG11在精子成熟过程中可能起到重要的作用,未成熟精子不具有运动能力,Zhou等[4]发现大鼠附睾中未成熟精子与附睾上皮细胞或能表达SPAG11E(Bin1b)的小肠上皮细胞共同培养后具有了运动能力,而加入SPAG11E抗体后,未成熟精子不具有运动能力;此外还发现,精子的运动能力随SPAG11E表达量的降低而下降。牛的SPAG11D存在于发育后期的精子细胞中,且在精子细胞的尾部[8],与大鼠SPAG11E相类似,可能与精子的运动能力相关。

鉴于牛SPAG11D在抵御微生物对机体的侵害和生殖功能方面起到重要作用,本研究表达了牛SPAG11D融合蛋白,且具有很强的抑菌生物活性,而在生殖方面的功能将进一步分析研究。

教育期刊网 http://www.jyqkw.com
参考文献

[1] FR?魻HLICH O,PO C,YOUNG L G.Organization of the human gene encoding the epididymis-specific EP2 protein variants and its relationship to defensin genes[J]. Biol Reprod,2001,64(4):1072-1079.

[2] 刘新颜,李建斌,仲跻峰,等.精子相关抗原11(SPAG11)基因研究进展[J].畜牧与兽医,2011,43(2):95-98.

[3] PATIL A A,CAI Y,SANG Y,et al.Cross-species analysis of the mammalian beta-defensin gene family: Presence of syntenic gene clusters and preferential expression in the male reproductive tract[J].Physiol Genomics,2005,23(1):5-17.

[4] ZHOU C X,ZHANG Y L,XIAO L,et al.An epididymis-specific beta-defensin is important for the initiation of sperm maturation[J].Nat Cell Biol,2004,6(5):458-464.

[5] JANTOS C,BAUMG?魧RTNER W,DURCHFELD B,et al.Experimental epididymitis due to Chlamydia trachomatis in rats[J].Infect Immun,1992,60(6):2324-2328.

[6] YENUGU S,HAMIL K G,FRENCH F S,et al.Antimicrobial actions of human and macaque sperm associated antigen (SPAG) 11 isoforms: Influence of the N-terminal peptide[J].Mol Cell Biochem,2006,284(1-2):25-37.

[7] HALL S H,YENUGU S,RADHAKRISHNAN Y,et al.Characterization and functions of beta defensins in the epididymis[J].Asian J Androl,2007,9(4):453-462.

[8] AVELLAR M C,HONDA L,HAMIL K G,et al.Novel aspects of the sperm-associated antigen 11 (SPAG11) gene organization and expression in cattle (Bos taurus) [J].Biol Reprod,2007,76(6):1103-1116.

[9] 余树民,李计尚,张 于,等.SPAG11基因在雄性牦牛生殖器官中表达的检测[J].中国兽医科学,2014,44(5):538-544.

[10] 萨姆布鲁克J,拉塞尔D W.分子克隆实验指南[M].第三版.黄培堂,译.北京:科学出版社,2002.

[11] 李闻文,阎祖炜,戴 橄,等.泌尿生殖道微生物感染检测及细菌药敏试验[J].湖南医科大学学报,2003,28(3):269-271.

[12] 邵长凤,张维嘉.男性泌尿生殖道病原微生物与不育的关系[J].中国计划生育学杂志,2004(3):187-189.

(责任编辑 程碧军)