中药提取物诱导骨肉瘤细胞程序性死亡研究进展

　摘要：细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）是经特定信号转导途径调控的细胞死亡，PCD的失序紊乱会引起肿瘤等疾病，这些信号转导途径依赖或不依赖半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶。中药在治疗骨肉瘤方面有一定疗效，其有效成分及干预机制的研究日益增多。本文对近年来中药提取物诱导骨肉瘤细胞程序性死亡的研究做一综述。
　　关键词：细胞程序性死亡；细胞凋亡；骨肉瘤；中药；综述
　　DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.038
　　中图分类号：R273.8 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）02-0127-03
　　Research Progress in Chinese Herbal Medicine Inducing Programmed Cell Death of Osteosarcoma JIANG Su-min， ZHAN Hong-sheng， CHEN Dong-yu， ZHANG Ji-wei （Shi’s Center of Orthopaedics and Traumatology， Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of TCM； Institute of Orthopaedics and Traumatology， Shanghai Academy of TCM， Shanghai 201203， China）
　　Abstract： programmed cell death （PCD） is cell death regulated by the specific signaling pathways. The disorder of PCD may cause diseases， such as tumor. These signal transduction pathways rely or do not rely on caspase. Traditional Chinese medicine has some efficacy for the treatment of osteosarcoma， and the number of study on its active ingredients and intervention mechanism is increasing. This article reviewed study on traditional Chinese herbal medicine which can inhibit osteosarcoma through the induction of PCD.
　　Key words： programmed cell death； cell apoptosis； osteosarcoma； traditional Chinese medicine； review
　　细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）是由特定基因控制、经特有的信号转导途径调控、稳步发生的细胞主动性死亡，是机体维持细胞数量平衡的重要机制，PCD的失序紊乱会引发肿瘤在内的一系列疾病。PCD根据是否有半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）家族的参与，分为caspase依赖的细胞程序性死亡（CD-PCD）和非caspase依赖的细胞程序性死亡（CI-PCD）。骨肉瘤是原发于骨骼的恶性肿瘤，常发生于儿童和青少年，恶性程度高、易转移。中医药在治疗肿瘤方面具有一定疗效，因此，天然药物提取物也成为研究抗肿瘤的新方向。兹就中药提取物诱导骨肉瘤PCD研究进展作一综述。
　　1 caspase依赖的细胞程序性死亡
　　CD-PCD，即经典的“细胞凋亡”，形态上表现为细胞皱缩、核染色质固缩、胞核裂解、胞膜空泡化、凋亡小体形成。caspase家族是在CD-PCD信号转导中起关键作用的酶蛋白，按功能不同，可分为启动因
　　基金项目：上海市科学技术委员会科研计划（13401903400）
　　通讯作者：陈东煜，E-mail：jiangsumin028@sina.com
　　子（caspase8、9、10、12等）和效应因子（caspase3、6、7等）。效应因子可降解细胞结构蛋白和功能蛋白，最终导致细胞凋亡；启动因子则位于上游，激活效应因子功能。整个CD-PCD过程根据信号转导机制不同可分为3种，即线粒体途径、死亡受体途径和内质网（ER）途径，分别依赖不同的caspase蛋白完成凋亡过程。
　　1.1 线粒体途径
　　线粒体是真核细胞提供能量和产生活性氧（ROS）的主要场所。胞内外的刺激均可以启动线粒体途径，具体表现和指征为胞内ROS增加、线粒体膜电位（ΔΨm）耗竭、胞质内细胞色素c增多等。经线粒体途径引发的凋亡主要经历线粒体膜通透性（MMP）增强、线粒体膜通透性转运孔道（MPTP）开放、细胞色素c释放入胞质与Apaf-1、caspase9前体形成凋亡复合体，激活caspase9和caspase3，最终导致细胞凋亡的过程。在此过程中，Bcl-2蛋白家族的作用显著，主要调控线粒体外膜的完整性和MPTP的开放，根据功能不同，Bcl-2家族分为促凋亡蛋白（Bax、Bak、Bcl-XS、Bid、Bad及HRK等）和抑凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-W、B?-1、Bcl-B及Mcl-1等）。促凋亡蛋白收到凋亡信号刺激后活化，部分原本定位于胞质的蛋白（如Bax）移位至线粒体外膜，部分原本定位于线粒体外膜的蛋白（如Bak）发生构象变化，最终在线粒体外膜形成孔道，细胞色素c释放，促成凋亡；相反地，抑凋亡蛋白则抑制该过程。
　　据目前的研究成果，线粒体途径是中药提取物诱导骨肉瘤细胞凋亡的主要机制。淫羊藿素致细胞内ROS浓度增高[1]，ROS增多启动线粒体途径，活化caspase9、caspase3，诱发凋亡，caspase3抑制剂可以阻断此过程[2]。氧化苦参碱[3]、人参皂苷[4]、毛竹叶水提物[5]、小檗胺及其衍生物[6]能上调Bax、Bad表达，下调Bcl-2表达，线粒体释放细胞色素c入细胞质，随后激活caspase9、caspase3，裂解底物聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（PARP），诱导骨肉瘤细胞凋亡；氧化苦参碱和小檗胺[7]还能体内抑制裸鼠移植瘤的生长。　姜黄素[8]、雷公藤甲素[9]、芹黄素[10]、山柰酚[11]及白英醇提物[12]诱导骨肉瘤细胞凋亡的机制是多途径的。在线粒体途径中，它们能上调促凋亡蛋白Bid、Bax，下调抑凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL，降低ΔΨm，并释放细胞色素c，最终激活caspase9、caspase3；Survivin是凋亡抑制蛋白（IAPs）家族成员，是caspase3、caspase7等酶的抑制物，姜黄素[13]和奇果菌素[14]还能抑制其表达，促进细胞凋亡。
　　1.2 死亡受体途径
　　细胞膜分布着一些与细胞凋亡相关的死亡受体，如Fas/CD95、肿瘤坏死因子受体1（TNF-R1）、TNF相关凋亡诱导配体受体1/2（TRAIL-R1/2）等[15]，胞外刺激信号增强所致的配体受体反应可以激活caspase8，从而直接激活下游的效应因子caspase3，导致细胞凋亡；另外，caspase8还可激活胞质中促凋亡蛋白Bid转移至线粒体膜，打开外膜通道，细胞色素c释放至胞质，最终导致细胞凋亡。
　　芹黄素可上调抑癌基因p53表达，激活caspase8，诱导细胞凋亡，并于体内抑制移植瘤生长[10]；雷公藤甲素上调死亡受体Fas及其配体FasL表达[9]，白英醇提物能激活Fas和TRAIL-R，它们均能活化caspase8、caspase3，促进细胞凋亡[12]。
　　1.3 内质网应激途径
　　ER是蛋白质合成、折叠，以及钙离子（Ca2+）储存的重要场所。ER受胞内外信号刺激后，启动非折叠蛋白应答（UPR），并释放Ca2+入胞质，ER钙稳态的破坏和非折叠蛋白堆积导致内质网应激（ERS）。caspase12定位于ER，ERS后caspase12经多种机制被活化，活化的caspase12又剪切活化caspase9、caspase3，进而引起细胞凋亡。
　　在芹黄素作用下，骨肉瘤细胞U2OS中ROS和Ca2+浓度增高，诱发ERS，ER上的跨膜蛋白活化转录因子4（ATF）传递ERS信号，靶基因葡萄糖调节蛋白78（GRP）表达上调，caspase12、caspase3活化，促使细胞凋亡[10]；另外，芹黄素诱发的ERS使生长阻滞和DNA损伤诱导基因（GADD153）转录上调，GADD153是ER凋亡途径的重要因子，可以通过下调抑凋亡蛋白Bcl-2促进细胞凋亡[16]。
　　山柰酚能在体内外抑制骨肉瘤细胞增殖，并对正常成骨表现出低毒性，它诱导凋亡机制涉及线粒体和ER途径。山柰酚引起胞内Ca2+浓度升高，这种钙稳态的失衡除了诱发ERS，活化ATF6、GRP78、GRP94外，还活化了胞质中的半胱氨酸蛋白酶家族成员Calpain，激活caspase4功能，诱发凋亡[11]。
　　2 非caspase依赖的细胞程序性死亡
　　CI-PCD表现为无caspase蛋白激活且caspase蛋白抑制剂无法阻断凋亡过程，其形式有自体吞噬、凋亡样程序性死亡、坏死样程序性死亡、类凋亡、有丝分裂灾变、失巢凋亡等。目前针对CI-PCD研究中药提取物抗骨肉瘤的成果不多，相对明确的机制主要集中于以下两方面。
　　2.1 线粒体相关的非caspase依赖的细胞程序性死亡
　　凋亡诱导因子（AIF）和核酸内切酶（Endo G）正常情况下都存在于线粒体中，在胞内外刺激存在的情况下（如Bcl-2家族促凋亡蛋白表达、细胞内ROS增多、Ca2+浓度增高），它们从线粒体移位至胞质、再转移至胞中，导致核固缩、DNA裂解。此过程并不受caspase活性影响，不能被caspase抑制剂所阻断。
　　同是依赖线粒体途径，caspase非依赖和caspase依赖机制往往是同时发生的，中药提取物的作用机制也往往是双方面的。上文提到的白英醇提物[12]、芹黄素[10]、山柰酚[11]均能通过caspase非依赖途径，促进AIF和Endo G释放入核，直接剪切DNA，促成PCD。水鬼蕉提取物Pancratistatin的合成类似物对骨肉瘤细胞发挥选择性细胞毒性作用，对正常成骨肉瘤细胞和成纤维细胞无影响，它能提高细胞内ROS浓度，诱导线粒体释放AIF和Endo G，促进PCD，它与姜黄素同用有协同作用，但姜黄素单用无作用[17]。
　　2.2 自体吞噬
　　自噬是胞内出现双层膜包裹部分胞质和细胞器、蛋白质形成自噬体，并与溶酶体融合成自噬溶酶体，通过水解酶解降解其内容物的过程[18]。自噬相关基因（ATG）是参与自噬调控的一类蛋白家族，它们可以形成不同的复合体参与调控自噬体形成，通过基因敲除相关ATGs基因，细胞死亡减少。另外，ATG的同源基因也对自噬形成发挥重要作用，如基因敲除ATG6的同源基因Beclin-1后，细胞自噬水平降低，肿瘤发生率增高[19]；LC3是ATG8的同源基因，Ⅰ型LC3（胞质中游离形式）向Ⅱ型LC3（自噬体膜结合形式）转变是诱导细胞自噬体形成的关键步骤[20]。
　　老刺木胺生物碱可诱导细胞自噬，促进Ⅰ型LC3向Ⅱ型LC3转变，机制涉及的主要蛋白是ATG5；以芦荟大黄素作为光敏剂的光动力疗法能上调细胞内ROS水平，诱导骨肉瘤细胞自噬，电镜下可见典型自噬溶酶体，LC3-Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin-1表达增高[21]。
　　3 结语
　　从发生机制而言，CD-PCD和CI-PCD并不能截然分开，在PCD过程中，这2种机制往往同时发生、相互联系。而中药提取物的作用也往往是多靶点、多环节、多途径。中药提取物在诱导骨肉瘤细胞PCD方面具有一定的作用，但目前的研究还需深入。如何发现更多有效的提取物，更清楚地阐述中药抑制骨肉瘤的机制，并将其应用到临床中，是急需解决的问题。
　　参考文献：
　　[1] 刘玉亮，殷嫦嫦，张义平，等.淫羊藿素抗骨肉瘤的机制研究[J].中成药，2014，36（1）：4-9.