张至玮，李章磊，高 飞，曹玉震，夏波林，周宜君
（中央民族大学生命与环境科学学院，北京 １０００８１）
摘要：从前期建立的蒙古沙冬青［Ａｍｍｏｐｉｐｔａｎｔｈｕｓ ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｓ（Ｍａsｘｉｍ） Ｃｈｅｎｇ ｆ．］根转录本数据库中克隆得到１个编码ＤＲＥＢ类转录因子基因。结果表明，ＡｍＤＲＥＢ２．２基因序列全长１ ０４５ ｂｐ，开放阅读框（ＯＲＦ）为５９７ ｂｐ，编码１９８个氨基酸，具有典型的ＤＲＥＢ转录因子保守的ＡＰ２结构域。实时荧光定量ＰＣＲ分析表明，该基因能在根、叶中表达，但对干旱、低温响应不同，ＡｍＤＲＥＢ２．２主要参与根的干旱胁迫应答。在ＡｍＤＲＥＢ２．２基因的编码区两端分别加入ＢａｍＨ Ⅰ和Ｓａｃ Ⅰ酶切位点，双酶切植物表达载体ｐＰＺＰ２１２和带有酶切位点的ＡｍＤＲＥＢ２．２基因ＰＣＲ产物，成功获得了ＡｍＤＲＥＢ２．２的植物过表达载体ｐＰＺＰ２１２－ＡｍＤＲＥＢ２．２。
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关键词 ：蒙古沙冬青［Ａｍｍｏｐｉｐｔａｎｔｈｕｓ ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｓ（Ｍａsｘｉｍ） Ｃｈｅｎｇ ｆ．］；ＡｍＤＲＥＢ２．２基因；表达特征；植物表达载体
中图分类号：Ｑ７８ 文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０15）16－4065-05
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.16.061
收稿日期：２０１４－１２－１７
基金项目：国家自然科学基金项目（３１３７０３５６）；中央民族大学“９８５工程”学科建设项目（ＹＬＤＸ０１０１３）；国家大学生创新训练项目（ＧＣＣＸ２０１４１１００２０）；中央民族大学研究生科研创新项目（Ｋ２０１４０４４）
作者简介：张至玮（１９９３－），女，陕西安康人，在读本科生，研究方向为植物抗逆分子生物学，（电话）１３８０１０４７２２６４（电子信箱）ｚｈｉｗｅｉ＿ｍｕｃ＠１６３．ｃｏｍ；通信作者，周宜君（１９６４－），女，福建福州人，教授，博士，主要从事植物抗逆分子生物学研究，（电子信箱）ｚｈｏｕｙｉｊｕｎ＠ｍｕｃ．ｅｄｕ．ｃｎ。
植物中应答逆境胁迫的基因通常按照功能分为两类，一类是功能基因；另一类是调控基因。转录因子基因作为调控基因的一种，可以与真核基因启动子的顺式作用元件结合，从而达到激活或者抑制转录的目的［１，２］。目前，已经获得了多种转录因子基因，将其应用于植物抗逆基因工程的研究取得了重要进展［３，４］。其中，对ＤＲＥＢ（Ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ）转录因子基因的研究较多［５－７］。ＤＲＥＢ转录因子属于ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）家族成员，受干旱、高盐或低温诱导表达，其氨基酸序列的Ｎ末端具有核定位信号，Ｃ末端具有转录激活结构域，而位于中部的ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ结构域非常保守，由５８个氨基酸组成，能形成３个β－折叠和１个α－螺旋，两个结构都可以结合到ＤＲＥ元件的核心结构ＰＵＣＣＧＡＣ上［３，８］。研究表明，ＤＲＥＢ２转录因子基因主要参与调控植物应答干旱、高盐和热激胁迫的基因表达［３，９］。
蒙古沙冬青［Ａｍｍｏｐｉｐｔａｎｔｈｕｓ ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｓ（Ｍａsｘｉｍ） Ｃｈｅｎｇ ｆ．］隶属豆科沙冬青属，为中亚荒漠中的孑遗植物，具有极强的耐旱、耐低温、耐瘠薄等抗逆特性，是集重要科学价值和生态价值于一身的研究材料。近年来，关于蒙古沙冬青的抗逆机理和抗逆基因资源的挖掘受到关注，并取得了重要研究进展［１０－１４］。本研究以蒙古沙冬青为研究材料，基于实验室前期建立的蒙古沙冬青根转录本数据库［１０］，克隆获得１个新的ＤＲＥＢ类转录因子基因，对其结构和逆境表达模式进行了分析，并构建了ＡｍＤＲＥＢ２．２基因的植物表达载体，为进一步通过异源表达验证ＡｍＤＲＥＢ２．２基因的生物学功能奠定了基础。
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 植物材料 蒙古沙冬青种子采自于宁夏回族自治区中卫县。
１．１．２ 菌株和质粒 ｐＰＺＰ２１２植物表达载体由中央民族大学生命与环境科学学院植物分子生物学实验室保存、大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５α购自北京博迈德科技发展有限公司、ｐＧＥＭ－Ｔ载体购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司。
１．１．３ 酶和试剂 Ｔｒｉｚｏｌ试剂购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；ＦａｓｔＱｕａｎｔ ｃＤＮＡ第一链合成试剂盒和ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ购自天根生化科技（北京）有限公司；胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ和限制性内切酶均购自Ｔｈｅｒｍｏ公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
１．２ 方法
１．２．１ 引物设计 根据蒙古沙冬青根转录本数据库中获得的ＤＲＥＢ相关基因序列，采用Ｐｒｉｍｅｒ ５．０设计引物，引物Ｐ２．２Ｆ－Ａ：５′－ＧＣＡＡＧＣＡＣＡＴＧＴＴＡＧＣＣＡＡＡ－３′；Ｐ２．２Ｒ－Ａ：５′－ＴＣＡＴＧＡＧＧＡＴＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡ－３′扩增目标基因。
根据荧光定量ＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ，ｑＲＴ－ＰＣＲ）检测引物的设计原则，设计基因检测引物和内参引物。引物Ｐ２．２Ｆ－Ｂ：５′－ＣＴＧＧＧＧＴＡＧＧＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧ －３′；Ｐ２．２Ｒ－Ｂ：５′－ＧＣＣＣＡＡＡＡＣＣＡＧＧＡＡＧＡＡＡＴ－３′扩增目标基因ＡｍＤＲＥＢ２．２片段。用引物ＰＡｍｅＩＦ１－Ｆ：５′－ＣＴＧＡＣＡＴＧＣＧＣＣＧＴＡＧＧＡＡＣＧ－３′；ＰＡｍｅＩＦ１－Ｒ：５′－ＣＣＣＴＧＣＴＴＡＴＧＣＣＡＧＴＣＴＴＴＴ－３′扩增内参基因ＡｍｅＩＦ１。
根据植物表达载体和目标基因的结构特点设计引物，引入ＢａｍＨ Ⅰ 酶切位点，下游加入Ｓａｃ Ⅰ酶切位点。引物序列为Ｐ２．２Ｆ－Ｃ：５′－ ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＡＡＧＣＡＣＡＴＧＴＴＡＧＣＣＡＡＡ－３′（划线部分为ＢａｍＨⅠ酶切位点）；Ｐ２．２Ｒ－Ｃ：５′－ＣＧＣＧＡＧＣＴＣＴＣＡＴＧＡＧＧＡＴＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡ－３′（划线部分为ＳａｃⅠ酶切位点）。
１．２．２ 材料培养与处理 种子萌发培养４周后，用含２０％ ＰＥＧ ６ ０００的１／２ Ｈｏａｇｌａｎｄ营养液浇灌，分别处理１、６、２４、７２ ｈ，然后４ ℃下分别处理１、３、６、２４ ｈ。以未胁迫处理（０ ｈ）为对照，分别取胁迫处理和未经胁迫处理后的植物根和叶片组织，称量后迅速放入液氮中，用于基因的克隆和表达模式分析。
１．２．３ ＡｍＤＲＥＢ２．２基因的克隆 采用改良的Ｔｒｉｚｏｌ 法分别提取不同胁迫处理的植物根和叶片组织总ＲＮＡ［１５］，用ＦａｓｔＱｕａｎｔ ｃＤＮＡ第一链合成试剂盒合成ｃＤＮＡ第一链。
以反转录得到的未经胁迫处理的ｃＤＮＡ为模板，以Ｐ２．２Ｆ－Ａ和Ｐ２．２Ｒ－Ａ为引物进行ＰＣＲ扩增目标基因，PCR反应体系（４０ μＬ）：２×Ｐｆｕ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ２０ μＬ，上、下游引物（１０ μｍｏｌ ／Ｌ）各１ μＬ，ｃＤＮＡ １ μＬ，ｄｄＨ２Ｏ １７ μＬ。ＰＣＲ反应条件为：９４ ℃预变性３ ｍｉｎ；９４ ℃变性３０ ｓ，５５ ℃退火３０ ｓ，７２ ℃延伸４５ ｓ，３０个循环；７２ ℃延伸５ ｍｉｎ；４ ℃保存。胶回收目的片段，与ｐＧＥＭ－Ｔ载体连接，转化Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α感受态细胞，挑取单克隆进行菌落ＰＣＲ检测，筛选出阳性克隆，送至北京华大基因研究中心测序。
１．２．４ ＡｍＤＲＥＢ２．２基因的生物信息学分析 分别采用相关生物信息学软件对获得的蒙古沙冬青编码ＤＲＥＢ基因ＡｍＤＲＥＢ２．２及演绎的氨基酸序列进行分析，具体分析目标及选用的相关软件见表１。
１．２．５ ＡｍＤＲＥＢ２．２的表达模式分析 采用ｑＲＴ－ＰＣＲ对不同胁迫处理下ＡｍＤＲＥＢ２．２在根和叶片中的表达模式进行分析，以未处理（０ ｈ）为对照，以ＡｍｅＩＦ１为内参基因。ＰＣＲ反应体系（１０ μＬ）：２×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ５ μＬ，上、下游引物（１０ μｍｏｌ/Ｌ）各０．３ μＬ，稀释后ｃＤＮＡ模板０．８ μＬ，ｄｄＨ２Ｏ ３．６ μＬ。反应条件：９５ ℃预变性５ ｍｉｎ；９５ ℃变性１０ ｓ，６０ ℃退火２０ ｓ，循环４０次；５５ ℃退火１０ ｓ（０．５ ℃／循环），循环８１次。采用基因表达相对定量分析，将对照样本的基因表达量设为１，处理样本中的基因表达量变化的倍数用２－△△Ｃｔ来表示，其中，△△Ｃｔ＝△Ｃｔ（处理）－△Ｃｔ（对照），△Ｃｔ＝Ｃｔ（目标基因）－Ｃｔ（内参基因），计算在不同处理下基因的表达量，其中每个处理重复３次，每个重复做３个平行。
１．２．６ ＡｍＤＲＥＢ２．２的表达载体构建与鉴定
１）含酶切位点ＡｍＤＲＥＢ２．２基因的扩增。以反转录得到的未胁迫处理的ｃＤＮＡ为模板，以Ｐ２．２Ｆ－Ｃ和Ｐ２．２Ｒ－Ｃ为引物进行ＰＣＲ扩增，反应体系（４０ μＬ）：２×Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ２０ μＬ，上、下游引物（１０ μｍｏｌ／Ｌ）各１ μＬ，模板ｃＤＮＡ １ μＬ，ｄｄＨ２Ｏ １７ μＬ。反应条件：９４ ℃预变性３ ｍｉｎ；９４ ℃变性３０ ｓ，６２ ℃退火３０ ｓ，７２ ℃延伸３５ ｓ，共３８个循环；７２ ℃延伸７ ｍｉｎ，４ ℃保存。胶回收含酶切位点的ＡｍＤＲＥＢ２．２基因，与ｐＧＥＭ－Ｔ载体连接，转化Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α感受态细胞，挑取单克隆进行菌落ＰＣＲ检测，筛选出阳性克隆，送至北京华大基因研究中心测序。
２）ＡｍＤＲＥＢ２．２表达载体构建与鉴定。以ｐＰＺＰ２１２作为植物表达载体。以ＢａｍＨⅠ和ＳａｃⅠ双酶切含有ＡｍＤＲＥＢ２．２的ｐＧＥＭ－Ｔ载体和ｐＰＺＰ２１２表达载体，分别胶纯化回收目的片段，将两个目的片段进行连接，转化Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α，在含有壮观霉素的ＬＢ固体培养基上筛选转化菌落。提取质粒，用ＢａｍＨⅠ和ＳａｃⅠ进行单酶切和双酶切验证。
２ 结果与分析
２．１ ＡｍＤＲＥＢ２．２基因全长的克隆
用改良Ｔｒｉｚｏｌ法提取蒙古沙冬青总ＲＮＡ，根据蒙古沙冬青根的转录本数据库中搜索获得的ＤＲＥＢ基因序列设计引物，进行ＰＣＲ扩增，获得的目的片段大小为６００ ｂｐ左右，扩增结果与预测结果一致（图１）。
２．２ ＡｍＤＲＥＢ２．２基因的生物信息学分析
采用ＤＮＡＭＡＮ ７．０分析获得的ＡｍＤＲＥＢ２．２基因全长序列，序列全长为１ ０４５ ｂｐ，其中５′ ＵＴＲ 长度为２０４ ｂｐ，３′ ＵＴＲ长度为２４４ ｂｐ。ＯＲＦ编码区长度为５９７ ｂｐ，可编码１９８个氨基酸，其等电点（ｐＩ）为８．６３，分子质量为２１ １４１．５４ ｕ。采用ＮＣＢＩ在线分析序列表明，此基因编码的蛋白质具有典型的ＡＰ２结构域，具有１１个ＤＮＡ结合位点，应属于ＡＰ２超家族成员（图２Ａ）。
二级结构预测表明ＡｍＤＲＥＢ２．１的二级结构主要有３种类型组成：α－螺旋、β－折叠片和无规则卷曲，３种结构所占比例不同，以无规则卷曲为主，β－折叠片较少（图２Ｂ）。
用ＳｉｇｎａｌＰ ３．０ Ｓｅｒｖｅｒ在线软件分析确定ＡｍＤＲＥＢ２．２不具有信号肽。用ＰＳＯＲＴ对ＡｍＤＲＥＢ２．２的氨基酸序列进行亚细胞定位分析，推测其定位于细胞核中。采用ｃＮＬＳ Ｍａｐｐｅｒ对ＡｍＤＲＥＢ２．２的氨基酸序列进行核定位信号分析，确定其核定位信号序列由２７个氨基酸构成。
２．３ ＡｍＤＲＥＢ２．２的系统进化分析
将ＡｍＤＲＥＢ２．２氨基酸序列与相近的１２个编码ＤＲＥＢ氨基酸序列进行比对并构建进化树。结果表明，各序列尽管长短有别，但都具有１２个保守的氨基酸，保守氨基酸的存在可能与ＡＰ２结构域有关（图３Ａ）。从构建的系统进化树可知，在选取的１３种ＤＲＥＢ蛋白质中，ＡｍＤＲＥＢ２．２与白刺花（Ｓｏｐｈｏｒａ ｄａｖｉｄｉｉ）ＳｄＤＲＥＢ２／ＡＦＰ８９５９０．１、拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＡｔＤＲＥＢ２Ａ、ＡｔＤＲＥＢ２Ｂ和ＡｔＤＲＥＢ２Ｃ，水稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）ＯｓＤＲＥＢ２Ａ／Ｑ０ＪＱＦ７．１和玉米（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ＺｍＤＲＥＢ２Ａ／ＡＮＰ＿００１１０５８７６．１聚为一类，其中与ＳｄＤＲＥＢ２最近；与大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）ＧｍＤＲＥＢ１／ＡＡＰ４７１６１．１、ＧｍＤＲＥＢ２／ＡＢＢ３６６４５．１和ＧｍＤＲＥＢ３／ＡＢＢ３６６４６．１、盐豆木（Ｈａｌｉｍｏｄｅｎｄｒｏｎ ｈａｌｏｄｅｎｄｒｏｎ）ＨｈＤＲＥＢ２／ＡＣＪ６６３７６．１以及已有文献报道的２个蒙古沙冬青中编码ＤＲＥＢ序列ＡｍＤＲＥＢ１［１６］和ＡｍＤＲＥＢ３［１７］关系较远（图３Ｂ）。
２．４ ＡｍＤＲＥＢ２．２的表达模式分析
２．４．１ 干旱胁迫下ＡｍＤＲＥＢ２．１的表达特征 以２０％ ＰＥＧ ６ ０００模拟干旱胁迫处理，采用ｑＲＴ－ＰＣＲ研究ＡｍＤＲＥＢ２．２在干旱胁迫下不同组织中的响应特点，结果见图４Ａ。ＡｍＤＲＥＢ２．２在根和叶片中的逆境表达模式不同，在不同干旱胁迫处理下根中ＡｍＤＲＥＢ２．２表现为迅速上调表达，其中１ ｈ表达量为对照水平的７．８４倍，６ ｈ表达量达到最大值，为对照水平的１３．４５倍；随着胁迫时间延长，２４、７２ ｈ表达量呈明显的回落趋势，与对照基本相同。而叶中ＡｍＤＲＥＢ２．２在不同干旱胁迫条件下表现为下调表达，２４ ｈ表达量显著下调，为对照水平的０．２６；随着胁迫时间延长，表达量有上升趋势。
２．４．２ 低温胁迫下ＡｍＤＲＥＢ２．２的表达特征 以４ ℃进行处理，采用ｑＲＴ－ＰＣＲ研究ＡｍＤＲＥＢ２．２在低温胁迫下的响应特点，结果见图４Ｂ。ＡｍＤＲＥＢ２．２在根和叶片中的逆境表达模式相似，与对照相比均表现为下调表达，但未达到显著水平。
２．５ ＡｍＤＲＥＢ２．２表达载体的构建
以ＢａｍＨⅠ和ＳａｃⅠ双酶切含有ＡｍＤＲＥＢ２．２的ｐＧＥＭ－Ｔ载体和ｐＰＺＰ２１２表达载体，分别胶纯化回收目的片段。将两个目的片段进行连接，获得重组载体ｐＰＺＰ２１２－ＡｍＤＲＥＢ２．２，转化Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α菌株，并在含有抗生素壮观霉素的ＬＢ固体培养基上筛选转化菌落。以Ｐ２．２Ｆ－Ｃ和Ｐ２．２Ｒ－Ｃ为上、下游引物，以含有重组载体ｐＰＺＰ２１２－ＡｍＤＲＥＢ２．２的菌液为模板，扩增得到约６００ ｂｐ的ＡｍＤＲＥＢ２．２特异条带（图５Ａ）。从两个单克隆１和３的菌液中提取质粒进行双酶切鉴定，结果见图５Ｂ。图中5B为双酶切产物，大片段长度约为１０ ｋｂ，小片段大小约为６００ ｂｐ；２和３分别为ＢａｍＨⅠ和ＳａｃⅠ的单酶切产物，大小约为１０ ０００ ｂｐ；４和５为重组质粒，表明ＡｍＤＲＥＢ２．２表达载体构建成功。
３ 小结与讨论
植物中的ＤＲＥＢ类转录因子成员较多，参与不同的逆境胁迫应答，如在拟南芥中，ＤＲＥＢ１基因主要受低温诱导表达，ＤＲＥＢ２基因则受干旱、高盐和高温诱导表达［１］。蒙古沙冬青为主要生长于中亚荒漠地区惟一的常绿阔叶灌木，具有极强的耐干旱、耐低温、耐贫瘠、耐受沙埋等特性。本研究从蒙古沙冬青中获得了１个编码ＤＲＥＢ类转录因子基因ＡｍＤＲＥＢ２．２，生物信息学分析表明其编码蛋白具有典型的ＤＲＥＢ 类转录因子所共有的保守ＡＰ２结构域和保守的氨基酸序列。系统进化分析表明，ＡｍＤＲＥＢ２．２与同为豆科的白刺花ＳｄＤＲＥＢ２亲缘关系最近，但与同为豆科的盐豆木ＨｈＤＲＥＢ２、大豆ＧｍＤＲＥＢ１和ＧｍＤＲＥＢ２以及已经报道的蒙古沙冬青ＡｍＤＲＥＢ１［１６］和ＡｍＤＲＥＢ３［１７］分属在不同的进化支上，同科植物以及同种植物不同成员之间的进化关系分析结果提示，这些成员可能存在功能上的差异。
Ｌｉ等［１８］研究了大豆ＧｍＤＲＥＢ不同成员的表达特征发现ＧｍＤＲＥＢｃ仅在根中受盐、干旱和ＡＢＡ诱导。本研究结果表明，ＡｍＤＲＥＢ２．２在蒙古沙冬青的根和叶片中均能表达，但在不同胁迫条件下，ＡｍＤＲＥＢ２．２在根与叶片的表达模式不同。ＡｍＤＲＥＢ２．２主要在根中受干旱胁迫的强烈诱导，而不受低温胁迫诱导，表明ＡｍＤＲＥＢ２．２主要参与蒙古沙冬青应答干旱胁迫的反应，且具有组织特异性，仅在根中积极响应，符合ＤＲＥＢ２类基因主要受干旱、高盐和高温诱导表达的特征。
植物的抗逆性是一个受多基因控制的数量性状，转化单一下游耐逆基因仅能在一定程度上提高植物的抗性，存在一定的局限性。而通过超表达转录因子可以激活更多的下游靶基因获得抗逆性，故而被认为是植物抗性基因工程的首选基因。本研究选择花椰菜花叶病毒（ＣａＭＶ）３５Ｓ作为启动子的ｐＰＺＰ２１２表达载体，成功构建了重组表达载体ｐＰＺＰ２１２－ＡｍＤＲＥＢ２．２，为进行异源表达验证基因功能以及植物抗性基因工程研究奠定了基础。
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