转Bt基因水稻对土壤微生物群落结构的影响

关潇１，吴刚２，王敏１

（１．中国环境科学研究院，北京１０００１２；２．华中农业大学植物科学技术学院，武汉４３００７０）

摘要：在大田环境下种植转Ｂｔ基因水稻（ＨＨＩ与Ｂｔ－ＳＹ６３）和亲本对照非转Ｂｔ基因水稻（ＭＨ６３与ＳＹ６３），分别在稻田休耕期、水稻苗期、分蘖期、抽穗期、成熟期、收获后采集土壤样品，分析转基因水稻种植对土壤微生物群落的影响，探讨转Ｂｔ基因水稻对土壤微生态系统的影响，旨在为转基因水稻的生态风险评价提供依据。结果表明，非转基因组土壤微生物群落结构特征具有一定的相似性，转基因组也具有类似的土壤微生物群落结构，但转Ｂｔ基因组水稻对土壤微生物群落结构具有一定影响；转基因水稻与非转基因组相比，土壤微生物生物总量差异不显著，转Ｂｔ基因水稻根际土壤中的细菌、真菌、放线菌随季节变化趋势明显，转基因组与非转基因组之间不存在显著差异（Ｐ＞０．０５）。

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关键词：转Ｂｔ基因水稻；土壤；微生物；细菌；真菌

中图分类号：Ｑ７８５；Ｓ５１１；Ｓ１５４．３７文献标识码：Ａ文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）０５－１０４６－０７

ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．０５．００６

收稿日期：２０１４－１２－１６

基金项目：国家转基因生物新品种培育重大专项（２０１４ＺＸ０８０１２－００５）；华中农业大学创新团队Ｂ类培育项目（２０１３ＰＹ０４６）

作者简介：关潇（１９７８－），女，山西怀仁人，博士，研究方向为遗传资源与生物安全，（电话）１８９７１６２１１２６（电子信箱）ｃｙｎｔｈｉａ８１５＠１２６．ｃｏｍ。

土壤微生物是土壤生态环境系统的重要组成部分，其多样性和活性是保持生态系统稳定的基础，而作物的改变不可避免地会影响土壤微生物区系的组成和结构，转基因作物的种植也可能对根际微生物的土壤环境产生影响，进而影响整个土壤生态系统的功能和农业生态系统的健康与稳定。转基因作物对土壤生态环境的影响是转基因作物安全评价的重要组成部分，因此，研究转基因作物对土壤微生物种群数量、活性等的影响具有极其重要的意义。转基因作物种植对土壤潜在影响的核心内容是其影响土壤的生态进程，此方面的研究主要集中于转Ｂｔ基因作物方面［１］。目前有关转基因作物外源基因的表达产物在土壤中的行为，主要以转Ｂｔ基因作物表达产物Ｂｔ蛋白在土壤中行为的研究为主。转基因作物释放外源基因表达产物进入土壤中的途径有很多种，其中最直接的主要有三个方面，一是通过植株残茬残留［２］。随着水稻秸秆还田技术在农业生产上的大面积推广应用，转Ｂｔ基因水稻在收割前后遗留在田间的植株残茬通过耕作方式向土壤微生态系统释放Ｂｔ杀虫结晶蛋白是Ｂｔ毒蛋白进入土壤生态系统中最重要的途径。研究表明，Ｂｔ毒素可通过枯枝落叶残留在土壤中，并与土壤中的颗粒相结合而存在［３，４］。二是通过根系分泌。根系分泌物可影响土壤的生物学和理化性质，并对土壤养分的释放与有效性产生较大效应。三是通过花粉释放。转Ｂｔ水稻在花粉中会表达Ｂｔ杀虫结晶蛋白，转基因作物中花粉的散布成为外源基因逃逸的渠道之一［５，６］。转Ｂｔ基因作物长期种植会使Ｂｔ毒素在土壤生态系统中富集，影响土壤的特异生物种群、功能类群、土壤微生物多样性与活性以及土壤生态学过程［７］。

土壤微生物是土壤生物中的一个重要类群，是气候和土壤环境条件变化的敏感指标，土壤微生物群落结构和多样性及其变化在一定程度上反映了土壤的质量［８］。转基因作物的非收获部分随秸秆还田等进入土壤，作物残体较长时间存留于土壤中，延长了土壤微生物对植物组织的接触时间，作物残体在土壤中的降解过程及降解产物可能会对微生物群落及土壤酶活性产生一系列影响，转基因作物根系分泌物能否对土壤微生物群落产生负面的影响也是环境风险评估的重要组成部分。一些研究认为转基因作物对土壤微生物有显著影响。Ｄｏｎｅｇａｎ等［９，１０］发现种植转Ｂｔ基因马铃薯和转Bt基因抗虫棉秸秆土壤中的微生物数量、种类和组成与常规对照存在显著差异。任馨等［１１］研究转Ｂｔ基因水稻成熟期秸秆和同一时期亲本稻秸秆的添加对淹水土壤可培养厌氧细菌数量和细菌群落组成的影响结果表明，与亲本对照相比，培养初期克螟稻秸秆的添加对淹水土壤厌氧发酵性细菌、产氢产乙酸细菌、反硝化细菌和产甲烷细菌的数量产生了显著性影响，但培养后期这种显著性差异基本消失；ＰＣＲ结合变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）指纹图谱和主成分分析（ＰＣＡ）结果表明，两种秸秆处理土壤细菌群落组成在培养的第三周和第五周达到显著差异，随着培养时间的延长，两种秸秆处理土壤间细菌群落组成的差异逐渐减小；到培养的第11周，两种秸秆处理土壤间细菌群落组成的差异基本消失，尽管如此，在培养的整个过程中，秸秆处理土壤中可培养厌氧性细菌数量和土壤细菌群落的组成均与纯土对照存在显著差异。王洪兴等［１２］对秸秆降解土壤可培养微生物的研究表明，转Ｂｔ基因处理细菌数量显著低于非转基因处理，其秸秆降解对细菌群落具有负面影响。但是转Ｂｔ基因处理对真菌的影响不同于细菌，转基因水稻秸秆降解反而更有利于真菌的繁殖增长，其数量远远高于非转基因和对照，达到了极显著水平。放线菌、反硝化细菌在降解过程中的数量变化没有明显规律，转基因秸秆处理土壤和非转基因秸秆处理土壤放线菌之间的差异在有些阶段没有达到显著水平；转基因对反硝化细菌活性有一定负面影响，但其数量波动性较大，需要进一步研究探讨。徐晓宇等［１３］研究转Ｂｔ基因克螟稻秸秆对淹水条件下稻田土壤厌氧微生物种群的影响，结果表明转Ｂｔ基因水稻秸秆对水田土壤反硝化细菌和产甲烷细菌种群有显著的抑制作用（Ｐ＜０．０５）；对厌氧发酵细菌种群有显著的刺激作用（Ｐ＜０．０５）。以上的结果大部分来源于实验室的培养试验，目前田间试验研究转Ｂｔ基因水稻秸秆降解对微生物的影响结果还很缺乏，田间的试验结果更能反映转基因作物秸秆降解对土壤微生物的真实影响。

而另一些学者的研究表明转基因作物对土壤微生物的影响并不明显。Ｗｕ等［１４，１５］研究转Ｂｔ基因秸秆还土对可培养微生物的影响，结果表明除了某些时期有瞬时的可培养微生物含量差异外，转Ｂｔ基因对水稻秸秆还土并无持续的显著性影响。Ｗｉｄｍｅｒ等［１６］使用ＥＲＩＣ－ＰＣＲ技术检测温室模拟试验评价抗真菌转基因水稻对根际土壤细菌、放线菌、真菌数量的影响，结果表明，在水稻整个生长发育期间，供试转基因水稻根际土壤细菌、真菌、放线菌数量与相应亲本对照间差异不显著。李长林等［１7］应用非培养依赖法，在大田栽培条件下，探讨转基因棉花种植对根际土壤微生物区系组成的影响，发现转基因棉花对根际土壤微生物的影响不显著，这与黄威等［６］的研究结果一致，且李长林等［１７］研究认为棉花生育期是导致根际土壤微生物多样性变化的重要因素。李本金等［１８］的温室模拟试验表明抗真菌转基因水稻对根际土壤细菌、放线菌、真菌数量与相应非转基因水稻相比未见明显差异。张舒等［１９］研究表明转Ｘａ２１基因水稻对根际细菌影响很小。应用分子生物学技术研究发现，转Ｂｔ基因作物对土壤微生物群落结构、土壤微生物功能多样性、微生物量、微生物活性均无显著影响［２０－２３］。

１材料与方法

１．１试验地基本概况

试验地位于山东省宁津县余斗村，北纬３７°３１′－３７°５１′，东经１１６°３０′－１１７°０２′，属于温带大陆性气候。其基本特点是四季分明，冬季漫长，夏次于冬，春秋短暂。该区域海拔１６．５ｍ，年均气温１２．９ ℃，年降水量５００~８００ｍｍ。４月１日进入春季，多西南风，气温回升快，蒸发量大，降水稀少，多春旱。夏季为期１０８ d左右，此季高温、高湿、雨量集中，平均降水４１０．７ mm，占全年降水量的７０．７％，平均每年有２０-３０ d的“梅雨”季节。宁津县于９月６日温度降至２２ ℃以下进入秋季，至１０月３０日仅５６ d。寒流的频袭是宁津县冬季的主要特征。该地区土壤类型为蒙淤砂白土，属于潮沙土。表１为宁津试验地土壤的基本理化性质。

１．２试验材料

本研究在试验设计时，种植转Ｂｔ基因水稻田与种植非转基因水稻对照田全生育期不施用农药防治害虫，排除了农药对水稻根际微生物的影响，有利于说明稻田土壤微生物之间的差异。２０１２年５－１１月在山东宁津试验站转基因水稻试验基地开展大田试验，转基因水稻及其对照品种均由华中农业大学提供，供试品种分别为转基因抗虫水稻华恢１号（ＨＨＩ）及其亲本对照明恢６３（ＭＨ６３）、杂交种Ｂｔ汕优６３（Ｂｔ－ＳＹ６３）及其亲本对照汕优６３（ＳＹ６３）。

试验采用随机区组设计，设转基因水稻和对照品种共４个处理，每个处理设４个重复，每个试验小区面积为１５０ｍ２。从５月１１日开始采样，约每隔３０ｄ采样１次，共采样６次。采用对角线五点取样，每个样点分０～１０ｃｍ、１０～２０ｃｍ和２０～３０ｃｍ三个土层取样，分别将各点土样按四分法混合均匀。装好袋后，系好内外标签。标签上注明采样地点、深度、作物前茬、施肥水平、采集人和日期，带回室内分析。

１．３试验方法

本试验的具体试验方案如图１所示。

本试验中磷脂脂肪酸（ＰＬＦＡ）的提取与测定采用修正的Ｂｌｉｇｈ与Ｄｙｅｒ方法进行脂类抽取与磷脂脂肪酸分析［２４－２７］。

１．４数据分析

数据统计分析采用统计软件ＳＰＳＳ１７．０（ＦｏｒＷｉｎｄｏｗｓ）。

２结果与分析

本试验测定了Ｃ１２到Ｃ２０的３７种磷脂脂肪酸，结果如图２所示。从图２可以看出，相对而言，两个转Ｂｔ基因处理组ＨＨＩ和Ｂｔ－ＳＹ６３分别与其亲本ＭＨ６３和ＳＹ６３相比，其特征脂肪酸１４∶０ｉ，１５∶０ａ，１６∶１ｗ７ｃ，１６∶０，１７∶０，１８∶１ｗ７ｃ（磷脂脂肪酸结构代码）等含量略有增加，而特征脂肪酸１６∶０ｉ，１６∶０（１０Ｍｅ），１７∶０ｉ，１７∶０ａ，１７∶０ｃｙ，１６∶１２ＯＨ，１７∶０（１０Ｍｅ），１８∶２ｗ６，９ｃ，１８∶０（１０Ｍｅ），１９∶１ｗ１１ｃ的含量降低，说明转Ｂｔ基因水稻对田内土壤微生物数量有影响。ＨＨＩ与Ｂｔ－ＳＹ６３两个转基因水稻品种相比，ＨＨＩ处理的特征脂肪酸１５∶０ｉ，１５∶０ａ，１６∶０ｉ，１７∶０ｉ，１７∶０ａ和１６∶１２ＯＨ的相对丰度减少，特征脂肪酸１６∶１ｗ７ｃ，１６∶０，１８∶１ｗ７ｃ和１８∶２ｗ６，９ｃ的相对丰度增加；Ｂｔ－ＳＹ６３处理使得真菌特征脂肪酸（１８∶２ｗ６，９ｃ）与细菌特征脂肪酸（１５∶０ｉ＋１５∶０ａ＋１６∶０ｉ＋１６∶１ｗ５ｃ＋１７∶０ｉ＋１７∶０ａ＋１７∶０ｃｙ＋１７∶０＋１８∶１ｗ７ｃ＋１９∶０ｃｙ）的比值发生较大的变化，Ｂｔ－ＳＹ６３的比值远远大于其亲本ＳＹ６３，与另一转基因水稻ＨＨＩ相比，虽然也高于其亲本对照ＭＨ６３，但两者之间的差异并不显著。种植转基因水稻Ｂｔ－ＳＹ６３增加了土壤中真菌类群的比例，而对细菌类群则有一定的抑制作用。

图３、图４表明，转基因水稻ＨＨＩ和Ｂｔ－ＳＹ６３在各采样时期水稻稻田内细菌含量分别低于其亲本对照组ＭＨ６３和ＳＹ６３；而真菌数量分别高于对照组。图５为转Ｂｔ基因水稻与其亲本之间根际土壤放线菌随季节的变化，７、８、９月转基因水稻ＨＨＩ和Ｂｔ－ＳＹ６３分别高于其亲本对照组。这说明转Ｂｔ基因水稻对土壤微生物数量产生了影响。

通过比较发现转Ｂｔ基因水稻与对照水稻品种根际土壤中的细菌、真菌以及放线菌等各类微生物随着时间的改变呈现一样的动态变化趋势，７、８月达到高峰，之后又缓慢下降到较低的水平，在１１月出现最低值。从微生物的组成来看，真菌、放线菌的组成比例略有升高，而细菌的比例有所下降，但没有显著差异（Ｐ＞０．０５）。

表２为本试验转Ｂｔ基因水稻根际土壤微生物磷脂脂肪酸的聚类分析对比结果。通过对此次试验检测中Ｃ１２到Ｃ２０的３７种磷脂脂肪酸的聚类分析发现ＭＨ６３、ＨＨＩ、ＳＹ６３和Ｂｔ－ＳＹ６３等不同品种的四个重复都在很多的距离尺度上聚成一类，但转Ｂｔ基因水稻ＨＨＩ与其亲本对照ＭＨ６３、Ｂｔ－ＳＹ６３与其亲本对照ＳＹ６３相比，其真菌、细菌、放线菌之间差异显著。两个亲本对照ＭＨ６３与ＳＹ６３的土壤在距离尺度为１４处聚成一类，显示出种植这两种水稻其田内土壤微生物群落结构的特征具有一定的相似性；而ＨＨＩ则与Ｂｔ－ＳＹ６３这两个转基因水稻具有类似的土壤微生物群落结构。与对照田土壤微生物相比，转Ｂｔ基因水稻土壤微生物的类群结构和数量都发生了显著变化。

图６、图７、图８为不同土层深度稻田内土壤微生物量在５～１１月的变化对比图。通过对比可以发现，随着土层深度的加大土壤微生物量逐渐降低，水稻根系附近（０~１０ｃｍ）的土壤中微生物量要高于其他两个处理１０～２０ｃｍ和２０～３０ｃｍ。此外，土壤微生物量随着季节改变呈现明显的夏季＞秋季＞春季＞冬季的变化特点，冬季最低，夏季７、８两个月达到最高峰，这可能与土壤的温度、湿度，以及土壤的底物供应有关，因为湿度和温度的波动也可以明显地改变氨化作用、硝化作用及固氮作用的季节变化。夏季土壤中氨化细菌、硝化细菌与固氮细菌数量最多，冬季最少的结果也与之相吻合。两个转基因品种ＨＨＩ和Ｂｔ－ＳＹ６３分别与其亲本对照ＭＨ６３和ＳＹ６３相比，微生物量在各个季节均呈现上升的趋势。对于两个非转基因品种来说，ＭＨ６３的微生物量要略微高于ＳＹ６３，两者之间差异不显著；ＨＨＩ又略高于Ｂｔ－ＳＹ６３，两者差异也不显著。表明转Ｂｔ水稻对土壤微生物量有影响。

３讨论

转基因作物及其产物进入土壤后，可能与土壤微生物相互作用，影响微生物活动过程［７］。一些研究表明，种植转基因作物对土壤微生物产生了明显的影响。对转Ｂｔ基因棉花的研究表明，种植转Ｂｔ基因抗虫棉的土壤中，微生物的数量、组成和种类与常规棉差异显著［２８，２９］；在整个生育期，Ｂｔ水稻“克螟稻”根际土壤中的细菌数量显著低于其非转基因亲本根际土壤，而真菌数量则相反［３０］；王洪兴等［１２］对秸秆降解土壤可培养微生物的研究表明，转Ｂｔ基因作物秸秆处理细菌数量显著低于非转基因处理，其秸秆降解对细菌群落具有负面影响；但是转Ｂｔ基因处理对真菌的影响不同于细菌，转Ｂｔ基因水稻秸秆降解反而更有利于真菌的繁殖增长，转基因数量远远高于非转基因和对照，达到了极显著水平。Ｃａｓｔａｌｄｉｎｉ等［３１］报道，使用ＤＧＧＥ观察到转Ｂｔ基因玉米和亲本非转基因玉米的总１６ＳｒＲＮＡ和代谢活性１６ＳｒＲＮＡ片段存在连续的显著性差异，用显微镜观察到菌根也存在显著性变化（在转Ｂｔ基因玉米根际中Ｇ.ｍｏｓｓｅａｅ真菌的数量水平更低）。Ｒｕｉ等［３２］发现，在棉花生长的早期和中期，非转Ｂｔ基因棉花根际土壤中的可培养功能细菌（解钾细菌、无机解磷菌、固氮细菌）的数量高于转Ｂｔ基因棉花；然而，棉花收割后显著性差异消失，纯化ＣｒｙｌＡｃ蛋白并不影响对这些群体的数量。而另一些研究则表明，种植转基因作物对土壤微生物没有显著影响。Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ等［３３］利用磷脂脂肪酸分析方法研究表明，土壤微生物群落结构在转Ｂｔ基因抗虫玉米和非转Ｂｔ基因玉米间没有显著差异。Ｓａｘｅｎａ等［３４，３５］研究发现种植转Ｂｔ基因和非转基因玉米的根际土壤中可培养微生物（细菌、放线菌和真菌）菌落形成单位（Cｏｌｏｎｙ－ｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔｓ）的数量不存在明显变化；同时，分别用转Ｂｔ基因和非转Ｂｔ基因玉米残茬补充后的土壤中这些微生物的数量也不存在明显差异。在转Ｂｔ基因抗虫棉对土壤微生物群落结构水平的研究中发现，微生物数量与对照间的差异不显著［３６，３７］。对转Ｂｔ基因抗虫水稻的研究表明，转Ｂｔ基因抗虫水稻的秸秆或根系还田对土壤细菌或真菌的群落组成也没有明显影响［３８，３９］。转Ｂｔ基因作物对土壤微生物未见影响的原因，研究表明可能是由于Ｂｔ蛋白在土壤中可快速降解［４０，４１］。

本研究将转基因水稻土壤中土壤真菌、细菌、放线菌的数量与其相应非转基因水稻进行了比较，结果证实，转Ｂｔ基因水稻土壤中真菌、细菌、放线菌的组成种类和数量发生了变化，真菌和放线菌呈上升的趋势，细菌呈下降的趋势，说明转Ｂｔ基因水稻对稻田中土壤微生物产生了影响。这可能是转基因水稻的代谢产物渗透到土壤微生物的生存环境中造成的：一方面，转Ｂｔ水稻外源基因的表达产物可通过根系分泌物进入土壤中；另一方面，外源基因插入受体水稻后，改变了水稻的目标性状，引起水稻其他性状的变化，从而产生不同的根系分泌物，并输入到土壤中，引起微生物的类群组成和数量发生变化。

转Ｂｔ基因水稻土壤中真菌、细菌、放线菌的组成种类和数量发生了变化，真菌与放线菌的含量增多，而细菌的量减低。非转Ｂｔ基因水稻ＭＨ６３与ＳＹ６３的稻田内土壤微生物群落结构的特征具有一定的相似性；而ＨＨＩ则与Ｂｔ－ＳＹ６３这两个转Ｂｔ基因水稻具有类似的土壤微生物群落结构，说明转Ｂｔ基因水稻对稻田中土壤微生物产生了影响。本研究在试验设计时，种植转Ｂｔ基因水稻田和对照稻田全生育期不施用农药防治害虫，排除了农药对水稻根际微生物的影响，试验接近稻田的实际生态状况，有利于说明水稻根际分泌物与稻田土壤微生物之间的差异。

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