龚 徐，王晓琴，张 波，李荣飞，陈韩英
（石河子大学药学院，新疆 石河子 ８３２００２）
摘要：采用比色法和考马斯亮蓝法分别对新鲜葡萄叶中多酚和蛋白质含量进行测定。采用滴定法、比色法分别对新疆红地球葡萄叶片供试粉末中有机酸、皂苷及黄酮的含量进行测定。结果表明，新鲜葡萄叶片中多酚含量为０．３７％，蛋白质含量为１．０１％。葡萄供试粉末中有机酸含量为１．５9％，皂苷含量为1.11％，黄酮含量为０．50％。葡萄叶片中蛋白质含量丰富，其他４种生物活性物质成分含量高，可以作为一种可开发资源进行深入研究。
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关键词 ：葡萄叶；有机酸；多酚；皂苷
中图分类号：Ｓ６６３．１文献标识码：A文章编号：0439－８114（２０15）21－1190-05
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.041
收稿日期：２０１４－０４－１７
基金项目：国家自然科学基金项目（３０８６００３２；３１１６００５８）；新疆生产建设兵团博士资金项目（２０１１ＢＢ０１８）
作者简介：龚 徐（１９８７－），女，湖北武汉人，硕士，研究方向为生物技术制药，（电话）１３３２５６６５０３６（电子信箱）６９０６９９９１５＠ｑｑ．ｃｏｍ；通信作者，
王晓琴，讲师，硕士，主要从事生物制药方面研究工作，（电子信箱）ｗａｎｇｑ５１５５＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ。
葡萄的根、果、藤均可入药，葡萄叶有安胎、消肿、利尿的作用。在土耳其、希腊及中东一带，葡萄叶大都作为烹饪材料，其中最有名的菜是多马西（Ｄｏｌｍａｓｉ），是一种以葡萄叶包米和绞肉的菜肴。在新疆地区，生产建设兵团农十三师生产加工出口的无核白葡萄叶片投入至中东市场后获得了较好的经济效益。
葡萄是新疆的主要经济作物，是种植面积广的一种有生资源。截至２０１２年新疆葡萄种植面积达到12.56万hm2，占全国种植面积的２７％［１］。新疆葡萄品种资源丰富，有６００多个品种，有一定种植面积的品种有将近２０种，其中红地球由于其优良的口感，作为鲜食葡萄品种在新疆大面积种植，仅新疆农五师就拥有６个红地球葡萄种植团［２］。葡萄的种植面积逐年增加，为了保证果实的质量，葡萄种植期间需要多次除去植株外周叶片。以新疆北疆昌吉至石河子葡萄产区为例，长期以来葡萄叶资源大多用于酿酒工业和食用，而产生的废弃物大多被焚烧，不但造成资源浪费，还污染环境，造成了一定的资源损耗和经济浪费。对废弃的葡萄叶的研究可以使生态资源得到有效利用。
课题组前期利用高相液相色谱法检测到新疆红地球葡萄叶中总茋类化合物含量为３４．７７ ｍｇ／ｋｇ［３］。本试验选取新疆秋季废弃的红地球葡萄叶，对其中５种活性成分（有机酸、黄酮、多酚、皂苷和蛋白质）的含量进行测定，对明确资源价值、评价适用性作为参考。
１ 材料与方法
１．１ 材料和仪器
在石河子秋季生长健壮、长势较一致红地球葡萄叶中，选取１０月龄、大小相近的离体葡萄叶片（含叶柄），用去离子水洗净、擦干。
没食子酸、芦丁、葫芦素标准品购于宝鸡市辰光生物科技有限公司（纯度≥９８％）；牛血清白蛋白标准品购于Ｓｉｇｍａ公司（纯度≥９８％）；９５％乙醇（分析纯）购于天津市富宇精细化工有限公司。
主要仪器包括ＵＶ２４５０型紫外－可见分光光度计（日本岛津公司）；ＫＱ－５２００ＤＥ型数控超声波清洗器（昆明市超声仪器有限公司）；ＥＹＥＬＡ旋转蒸发仪ＳＢ－１０００（上海爱朗仪器有限公司）。
１．２ 方法
１．２．１ 葡萄叶中水分含量测定 采用鲜质量法测定葡萄叶片含水量和相对含水量［４］，随机取３０片大小一致、叶龄相近的叶片，从叶基部剪下，用去离子水洗净，擦拭掉叶片表面多余水分并称量鲜质量（初始鲜质量）。经１０５ ℃ ３０ ｍｉｎ 杀青后，７５ ℃烘至恒质量，称重（干质量）并计算其叶片含水量。
叶片含水量＝（初始鲜质量－干质量）/初始鲜质量×１００％。
１．２．２ 葡萄叶中有机酸的样品制备 将离体葡萄叶置１０５ ℃的烘箱中烘４ ｈ，取出冷却，研成细粉，放干燥器中备用。精密称取烘干至恒重的葡萄叶粉末２ ｇ，置于具塞锥形瓶中，精密加入０．０５ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ 溶液１００ ｍＬ，密塞，室温放置０．５ ｈ，抽滤，备用［５］。
１．２．３ 葡萄叶中多酚、皂苷和黄酮的样品制备 准确称取新鲜离体葡萄叶片２０ ｇ，按料液比１∶５（W/V）的比例用５０ ％乙醇超声６０ ｍｉｎ，温度为７０ ℃，过滤，提取２次［６］。用旋转蒸发仪浓缩提取液，得新疆红地球葡萄叶多酚粗提液。将离体葡萄叶片烘干、粉碎、过筛，称取１０ ｇ粉末，按料液比１∶１５（W/V）的比例用７０％乙醇回流提取２ ｈ，温度为７０ ℃［７］。用旋转蒸发仪浓缩提取液，得新疆红地球葡萄叶皂苷粗提液。将离体葡萄叶片烘干、粉碎、过筛，称取１０ ｇ粉末，按料液比１∶４０（W/V）的比例用４５％乙醇回流提取２ ｈ，温度为６０ ℃［８］。用旋转蒸发仪浓缩提取液，得新疆红地球葡萄叶黄酮粗提液。
１．２．４ 葡萄叶中蛋白质的样品制备 准确称取葡萄叶片１ ｇ，用 ３ ｍＬ ０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ溶液（ｐＨ ６．８）进行匀浆抽提，于４ ℃条件下浸泡４ ｈ，１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１８ ｍｉｎ，上清液为蛋白质粗提液［９］。
１．２．５ 葡萄叶片中化学成分的定性分析 将上述５种提取液，按照常规化学成分的定性检测方法进行检测。
１．２．６ 葡萄叶中有机酸含量测定方法 精密吸取２５ ｍＬ有机酸样品溶液３份于２５０ ｍＬ三角烧瓶中，分别加入去离子水２５ ｍＬ、酚酞指示剂２滴，用０．０５ ｍｏｌ／Ｌ 盐酸溶液进行滴定。记录溶液红色褪去时消耗标准酸溶液体积（ｍＬ），并计算平均值。同时滴定０．０５ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ 溶液２５ ｍＬ，记录空白溶液消耗标准酸溶液体积（ｍＬ） ，并计算平均值。计算葡萄叶片中有机酸的含量。
１．２．７ 没食子酸的标准曲线制定 采用福林酚法［１０］，精密称取没食子酸对照品３．００ ｍｇ，置于１０ ｍＬ容量瓶中，去离子水定容，摇匀，得没食子酸标准品溶液。精确吸取没食子酸标准品溶液０．０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５ ｍＬ，分别加入１ ｍＬ福林酚试剂和３ ｍＬ ７．５％ Ｎａ２ＣＯ３溶液，去离子水定容至１０ ｍＬ。室温避光放置９０ ｍｉｎ后，以第一管试剂作空白，进行全波长扫描， 结果在６５０ ｎｍ处有最大吸收峰。于６５０ ｎｍ处分别测定其吸光度。以没食子酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
１．２．８ 葫芦素Ｂ的标准曲线制定 比色法是测定皂苷最常用的方法，利用皂苷与一些试剂反应后显色，可在一定波长处进行测量。本试验采用香草醛－高氯酸作为显色剂，测定新疆红地球葡萄叶中皂苷的含量。精密称取３ ｍｇ葫芦素Ｂ标准品，定容至１０ ｍＬ，去离子水定容，摇匀，得葫芦素标准品溶液。精确吸取葫芦素标准品溶液０．０、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５ ｍＬ，分别置于１０ ｍＬ容量瓶中，加０．２ ｍL ５％香草醛－冰醋酸溶液，再加入０．８ ｍＬ高氯酸溶液，于７０ ℃恒温加热２０ ｍｉｎ，取出后冰水浴冷却５ ｍｉｎ，加冰醋酸５ ｍＬ，摇匀，以第一管试剂作空白，进行全波长扫描， 结果在４６３ ｎｍ 处有最大吸收峰。于４６３ ｎｍ处分别测定其吸光度。以葫芦素Ｂ浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
１．２．９ 芦丁的标准曲线制定 黄酮类物质利用铝离子与其３，４－二羟基发生络合反应显色来进行测定，显色剂选取亚硝酸钠－硝酸铝－氢氧化钠溶液。精密称取３ ｍｇ芦丁标准品，去离子水定容至１０ ｍＬ，摇匀，得芦丁标准品溶液。精确吸取芦丁标准液０．０、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５ ｍＬ，分别置于１０ ｍＬ容量瓶中， 加 ５％ ＮａＮＯ２溶液０．３ ｍＬ， 放置６ ｍｉｎ， 再加 １０％ Ａｌ（ＮＯ３）３溶液０．３ ｍＬ， 放置６ ｍｉｎ， 加４％ ＮａＯＨ溶液４． ０ ｍＬ， 加水至刻度， 摇匀， 放置１５ ｍｉｎ， 以第一管试剂作空白，进行全波长扫描， 结果在５００ ｎｍ 处有最大吸收峰。以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
１．２．１０ 牛血清白蛋白的标准曲线制定 根据蛋白质与染料相结合的原理设计。考马斯亮兰Ｇ－２５０染料在酸性溶液中与蛋白质结合， 使染料的最大吸收峰的位置由４６５ ｎｍ变为５９５ ｎｍ，溶液的颜色由棕黑色变为蓝色， 可在５９５ ｎｍ处进行比色测定［１１］。准确称取牛血清白蛋白１００．０ ｍｇ，用去离子水定容至１００ ｍＬ，即为１ ｍｇ/ｍＬ 蛋白质标准液，４ ℃保存待用。分别吸取０．０、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０ ｍＬ标准蛋白质溶液于１０ ｍＬ试管中，各管补加０．１５ ｍｏｌ／Ｌ 氯化钠溶液至１ ｍＬ，各取０．１ ｍＬ于新试管，然后加入５ ｍＬ考马斯亮蓝Ｇ－２５０溶液，摇匀，放置２ ｍｉｎ，于５９５ ｎｍ处测定其吸光度，绘制标准曲线。
１．２．１１ 葡萄叶中多酚、皂苷、黄酮和蛋白质含量测定 取新疆红地球葡萄叶多酚粗提液采用“１．２．７”法测定６５０ ｎｍ处吸光度，计算葡萄叶中总酚的质量分数。 取新疆红地球葡萄叶皂苷粗提液采用“１．２．８”法测定４６３ ｎｍ处吸光度，计算葡萄叶中皂苷的质量分数。取新疆红地球葡萄叶黄酮粗提液采用“１．２．９”法测定５００ ｎｍ处吸光度，计算葡萄叶中黄酮的质量分数。取新疆红地球葡萄叶蛋白质粗提液采用“１．２．１０”法测定５９５ ｎｍ处吸光度，计算葡萄叶中蛋白质的质量分数。
１．２．１２ 精密度，重复性及稳定性试验 精密度试验：精密吸取０．５ ｍＬ的４种标准品各５份，按相应方法进行测定，计算；重复性试验：精密称取４种标准品各５份，按上述处理方法平行操作测定，计算；稳定性试验：各取４种标准品，每隔０．５ ｈ测定吸光值，共５次。
２ 结果与分析
２．1 葡萄离体叶片初始鲜质量、干质量和葡萄叶片含水量
叶片含水量指叶片中的水分占叶片总质量的百分比。经计算叶片中平均含水量达到７７．２２％，见
表1。
２．2 ５种化学成分定性检测结果
通过对葡萄叶片进行化学成分定性检测，表明葡萄叶片中含有有机酸、酚类、皂苷、黄酮类物质和蛋白质，见表2。
２．３ 葡萄叶中有机酸含量测定结果
新疆红地球葡萄叶片粉末供试品中有机酸平均含量达到１５．８７ ｍｇ/ｇ，根据已测叶片含水量７７．２２％，估算得出新鲜红地球葡萄叶片中有机酸含量为３．６２ ｍｇ/ｇ。
２．４ 线性关系考察、精密度，重复性及稳定性试验结果
没食子酸、葫芦素Ｂ、芦丁和牛血清白蛋白４种标准品的标准曲线如表４所示，相关系数为０．９９９ １～０．９９９ ３，表明在设定浓度范围内，线性关系良好。精密度、重复性和稳定性均在５％以下。
２．５ 葡萄叶中多酚、皂苷、黄酮和蛋白质含量
新疆红地球葡萄叶片中多酚和蛋白质采用新鲜叶片测定，一定程度避免其分解。经测定，多酚含量达到３．７0 ｍｇ／ｇ，蛋白质含量达到１０．１１ ｍｇ／ｇ。
皂苷和黄酮的含量采用烘干后葡萄叶片粉末测定，排除水分干扰。皂苷含量为１１．０９ ｍｇ／ｇ，黄酮含量为４．９５ ｍｇ／ｇ。根据所测含水量换算成鲜重含量，其中新鲜叶片中皂苷含量为２．５２ ｍｇ／ｇ，黄酮含量为１．１３ ｍｇ／ｇ（表５）。
２．６ 葡萄叶提取液中多酚、皂苷、黄酮和蛋白质加样回收率
各取已知含量的葡萄叶多酚、皂苷、黄酮和蛋白质提取液，分别加入对应标准品没食子酸、葫芦素Ｂ、芦丁和牛血清白蛋白，在相应测定方法下测定吸光度。计算回收率，见表６至表９。４种测定方法的回收率较好，达到了测定要求。
２．7 葡萄叶片中５种活性成分比例分布
根据所测的新疆红地球葡萄叶片含水量，将叶片中的有机酸、皂苷和黄酮的含量换算成鲜重比例，与测得的多酚和蛋白质含量进行比较。结果表明在测定的５种活性成分中，有机酸、蛋白质占了绝大部分的比例，分别为４８％和３０％，接下来依次为多酚、皂苷、黄酮（图1）。
３ 小结与讨论
葡萄中含有的有机酸、多酚及黄酮等物质具有抗肿瘤、抑菌、抗氧化、降血脂等广泛的生物活性。Ｌａｎｄｒａｕｌｔ等［１２］和Ｂａｖａｒｅｓｃｏ［１３］等发现葡萄叶、茎、果实中一些特殊活性的茋类物质，具有潜在利用价值。文献［１４］对葡萄子组成成分及各组分含量进行了研究，发现其中所含的化学成分具有很强的清除自由基的能力。前期工作也表明葡萄叶中含有丰富的茋类化合物，美国红提中的白藜芦醇含量达到３．３４ μｇ/ｇ，白藜芦醇苷的含量达到２３．７３ μｇ/ｇ［３］。
葡萄叶来源于自然，安全无害，是一种传统中药材， 可治疗呕吐、水肿、小便不利、目赤等症［１５］。新疆葡萄叶资源丰富，但是目前国内研究报告较少。本研究对新疆红地球葡萄叶片中５种生物活性成分进行测定，为葡萄叶的开发利用提供理论依据。测定结果表明，新疆红地球葡萄叶中有机酸、蛋白质、多酚、皂苷和黄酮，含量分别为0.36％、１．０１％、０．３７％、０．２５％、０．１１％。由图１可看出测定的５种活性成分中，有机酸含量最高，这与葡萄中含有大量的苹果酸、酒石酸和柠檬酸有关［１６］。叶片中蛋白质占１．０１％，折合干重含量为3．62 ｍｇ／ｇ，占干重比例的４．４３％，与植物大豆２１．０４％相比较低，与禾本科水稻５．５５％接近［１７］。葡萄叶中蛋白含量丰富，可以作为饲料添加剂，国内外大量饲养试验表明植物蛋白质具有明显的增加胴体重量、改善禽鱼肉蛋等产品质量、降低饲料消耗率等作用。从图１中也可以看出葡萄叶片中皂苷、多酚和黄酮含量也十分丰富。
随着研究不断深入，有机酸具有的抗肿瘤、抑菌、抗血栓、抗艾滋病毒、降血脂等功效逐步被发现［１８］，其提取成为了研究热点。而葡萄叶片中有机酸含量高达3.62 ｍｇ／ｇ，可以作为一种天然的提取分离物；本研究测定发现新鲜新疆红地球葡萄叶中多酚含量为３．７0 ｍｇ／ｇ，虽然与葡萄皮渣（４２．５１±１．２１） ｍｇ／ｇ［６］相比含量偏低，但由于葡萄叶产量相对巨大、来源简单，可以作为一种经济的多酚提取物资源；在对黄酮和皂苷的含量测定中，发现黄酮类物质含量为1．１3 ｍｇ/ｇ，与已报道的吐鲁番葡萄叶片黄酮含量５．３３ ｍｇ/ｇ［８］有一定差距。黄酮类物质是存在于自然界的一大类化合物，具有良好的药理活性，具有抗肿瘤、抗脂肪氧化、抗衰老等重要作用［１９］，而葡萄叶资源可以作为新的黄酮药源；目前国内尚无对葡萄叶中皂苷含量进行报道，本研究测定皂苷含量为2．５2 ｍｇ／ｇ。皂苷不仅可以作为药材发挥降血糖、抗氧化、提高免疫力等功效，还可以作为高级化妆品和食品添加剂使用，如杀菌剂、发泡剂、抗氧化剂等使用。葡萄叶片中含有丰富的有机酸、蛋白质、多酚、皂苷和黄酮，其作为天然的自然资源具有广泛的开发前景和利用价值， 值得综合利用和开发。
本研究测定了葡萄叶片中水分及有机酸、多酚、皂苷、黄酮和蛋白质的含量，但对于葡萄叶中其他物质如多糖、纤维素、果胶等成分受试验条件所限尚未测定，所以反映的葡萄叶片成分含量还不够全面，有待今后进步一步研究。本研究可为今后进一步研究葡萄叶片中成分及其综合利用提供可借鉴的依据。
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（责任编辑 胡西洲）
