张慧娟 廖少羽
【摘要】目的探讨诱导痰ECP检测用于哮喘患儿诊断的临床价值。方法选取2010年2月至2013年6月在我院呼吸科门诊及住院的支气管哮喘患儿92例，按照临床症状及肺功能情况分为哮喘缓解组、轻度间歇组、中重度组，同期选取入院健康体检的正常儿童24例作为对照组，各组患儿均行痰液诱导及收集并进行含量检测，同时检测肺通气功能，对比分析各组间ECP及肺通气功能的差异，探讨ECP含量与肺通气功能指标的相关性。结果哮喘缓解期患儿与对照组ECP水平差异无统计学意义（p>0.05），而轻度间歇组、中重度组患儿的ECP水平较哮喘缓解组、对照组显著升高（p<0.01），且随着哮喘病情的加重而诱导痰ECP含量显著升高；对于肺通气功能指标的检测发现，轻度间歇组及中重度组患儿的FCV、FEV1%较哮喘缓解组、对照组显著降低（p<0.01），且随着病情的加重，其下降幅度增加；相关性分析发现，诱导痰液内ECP含量与FVC和FEV1.0%呈负相关性（p均＜0.01）。结论诱导痰内ECP含量能有效反映肺通气功能，同时可作为中重度哮喘及病情严重程度评估的临床指标，对于哮喘的临床诊断具有重要意义。
【关键词】哮喘 诱导痰 ECP 苏木素伊红染色
doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2014.07.029
哮喘，即慢性持续性支气管哮喘，是临床较为常见的呼吸道慢性炎症性疾病，尤其对于儿童而言，其临床多表现为咳嗽、喘息、胸闷等症状，严重者往往会导致呼吸困难，从而威胁患者的生命安全［1］。目前，哮喘的发病率呈上升趋势，因此，如何快速有效的诊断对于哮喘的治疗和预防具有重要意义。近年来对于哮喘的发病机制研究逐渐深入，多是由于气道炎症的发生引发的气道可逆性阻塞，炎症细胞在哮喘的发生及发展中起到关键的作用，这其中包括嗜酸性粒细胞(Eosinoohil，EOS)、肥大细胞、T细胞等等，尤其是EOS最具有特征性［2-3］。有研究显示，哮喘患者的嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)水平显著升高，且与哮喘的发病程度有关［4］。本研究选取2010年2月~2013年6月在我院呼吸科门诊及住院的支气管哮喘患儿92例，并同期选取入院健康体检的正常儿童24例作为对照组，收集诱导痰及行ECP含量及肺通气功能检测，对比分析各组间ECP及肺通气功能的差异，探讨ECP含量与肺通气功能指标的相关性，以期为哮喘的临床诊断提供理论依据。
1对象与方法
1.1研究对象
选取2010年2月~2013年6月在我院呼吸科门诊及住院的支气管哮喘患儿92例为研究对象，所有患儿均参照中华医学会儿科学分会呼吸学组制定的《儿童支气管哮喘防治常规》［5］中所述诊断标准进行确诊，哮喘患儿按照临床症状及肺功能情况分为哮喘缓解组、轻度间歇组、中重度组，其中哮喘缓解组患儿45例，男23例，女22例，年龄4~13岁，平均（7.83±2.84）岁；轻度间歇组34例，男19例，女15例，年龄5~13岁，平均年龄（7.76±2.62）岁，患儿近期内无感染发生，于进行测定前8h服用β2受体激动剂；中重度组患儿13例，男8例，女5例，年龄4~12岁，平均年龄（7.94±2.87）岁，哮喘发作期内无感染发生并根据患儿的实际情况接受使用β2受体激动剂。此外，选取同期入院健康体检的正常儿童24例作为对照组，男12例，女12例，年龄4~13岁，平均年龄（7.82±2.76）岁，24例儿童均未出现哮喘症状且无哮喘病家族史，近1月内未发生肺部感染，同时排除心、肝、肾功能障碍者及患有过敏性疾病及自身免疫性疾病的儿童。经两两对比，各组间患者的性别、年龄等一般资料的差异无统计学意义（p>0.05），具有可比性。
1.2研究方法
1.2.1痰液诱导对于痰液的诱导和采集，采用雾化吸入高渗盐水法进行。行痰液诱导前进行肺功能检查，包括一秒最大呼气量 （FEV1），以FEV1的下降程度不低于初测值的20%为准，观察患儿是否耐受痰诱导过程，对于FEV1为等于或小于初测值的65%时，须先雾化吸入喘乐宁气雾剂适量，以缓解胸闷、咳嗽等症状，对于FEV1下降50%以上时可嘱患者雾化吸入4%~5%的高渗盐水30 min，以促进患者肺部痰液的排出，无法自行咳出者可使用吸痰器吸出。本研究参照Pin ［6］等研究报道的方法进行，嘱患儿吸入沙丁醇200 μg，10 min后采用清水漱口并清理鼻腔，后采用5%高渗盐水进行超声雾化吸入，持续20 min左右，用力咳出痰液置于培养皿内，至少采集痰液量为0.6 ml，4℃冰箱内保存。
1.2.2痰液质量控制取收集痰液适量，加入4倍体积0.1%二硫苏糖醇（DTT），涡旋震荡以充分混匀，37℃恒温水浴10 min，以裂解糖蛋白纤维丝间的二硫键从而溶解痰液，后采用48 μm尼龙网过滤，除去黏液和碎片，3000 r/min离心10 min，分离上清，-80℃冷冻保存备用，对于细胞沉淀，采用4倍痰液体积的PBS缓冲液重悬，取适量加入新鲜配制的苏木素-伊红染色液进行染色［7］，光学显微镜下观察细胞活性、细胞计数及鳞状上皮细胞的百分比，其中以细胞活性>50%，鳞状细胞计数<20%为痰液合格。
1.2.3ECP测定对于ECP的测定，采用夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）法进行，其中，ECP ELISA检测试剂盒试验操作严格按照试剂盒说明书进行。
1.2.4肺通气功能测定肺通气功能检测，采用肺功能测定系统按照美国胸科协会(ATS)标准进行，检测前经经验丰富的技术人员进行环境参数、容量定标校准，记录各测试人员的肾功能高、体重等临床资料，并培训相关检测需做的规定动作。测试时嘱患儿上身坐直，头部自然水平，佩戴鼻夹、口器等以包紧口唇，以防漏气，同时要求患儿保持放松，或松解过紧的腰带及衣服领口进行测试。重复测量三次，取最佳值，记录各患儿的用力肺活量(FVC)、一秒钟用力呼气量(FEV1)，计算FEV1.0%（第一秒用力肺活量占用力肺活量的百分比）。
1.3统计学方法
所有数据均采用spss17. 0统计学软件进行，其中，ECP表达水平、肺通气功能指标等计量资料采用均值±标准差表示，组间对比行t检验；对于ECP表达水平及肺通气功能的相关性分析采用Pearson相关性分析，均以p<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1各组痰液的ECP水平比较
由表1可见，哮喘缓解期患儿虽较对照组ECP水平稍微升高，但差异无统计学意义（t=，P=），而轻度间歇组、中重度组患儿的ECP水平较哮喘缓解组、对照组显著升高（p<0.01）；对于发病期哮喘患儿而言，中重度组患儿诱导痰液ECP含量高达（152.4±65.7）μg/L，而轻度间歇组患儿为（92.3±56.2）μg/L，组间对比发现，中重度组诱导痰液ECP含量较轻度间歇组显著升高（t=3.130，p=0.003），表明患儿诱导痰液ECP含量随着哮喘病情的加重而显著升高。
2.2各组患儿肺通气功能指标间比较
对于肺通气功能指标的检测发现，对于FCV而言，哮喘缓解组患者与对照组间差异无统计学意义（t=0.222，p=0.825），而轻度间歇组及中重度组患儿较哮喘缓解组、对照组显著降低（p<0.01）；对于FEV1%，哮喘缓解组、轻度间歇组、中重度组患儿均较对照组显著降低（p<0.05），且随着病情的加重，其下降幅度增加。
2.3ECP含量与肺通气功能指标的相关性分析
对ECP含量与肺通气功能指标行Pearson相关性分析发现，诱导痰液内ECP含量与FVC 和FEV1.0%呈负相关性，r值分别为-0.546、-0.573，p均＜0.01，表明诱导痰ECP含量能够有效的反映肺通气功能。
3讨论
哮喘多以气道慢性炎症、 高反应性和气流阻塞为主要临床特征，炎症是导致其发生及发展的关键因素，多种炎症细胞及其分泌的细胞因子、炎症介质都参与哮喘的形成，其中，嗜酸性粒细胞浸润最为显著。嗜酸性粒细胞经活化可分泌ECP，其作为毒性蛋白，可破坏呼吸道上皮组织，使得腺体分泌亢进、血浆渗漏，导致组织胺释放增加，从而导致炎症发生［8］。近年来，诱导痰液的相关指标检测逐渐广泛应用，其作为直接来源于气道分泌物，对于反映气道炎症具有良好的效果，同时作为非侵入性的检测方法，安全无创，重复性好，且儿童易于接受［9］。甘明［10］等在对EOS、ECP及IL-13在哮喘发病机制的作用研究发现，支气管哮喘急性期患者的诱导痰液EOS、ECP含量较健康对照组明显升高（p<0.05），且与血清IL-13水平呈正相关，表明诱导痰内EOS、ECP检测可作为哮喘诊断及病情转归的重要指标。
本研究结果显示，哮喘缓解期患儿与对照组ECP水平差异无统计学意义（p>0.05），与之前文献报道［11］结果一致，可能是由于患儿个体差异的存在所致；轻度间歇组、中重度组患儿的ECP水平较哮喘缓解组、对照组显著升高（p<0.01），且随着哮喘病情的加重而诱导痰ECP含量显著升高，表明诱导痰液内ECP含量的测定，可有效的反应哮喘发病的严重程度。此外，在对肺通气功能指标的检测发现，轻度间歇组及中重度组患儿的FCV、FEV1%较哮喘缓解组、对照组显著降低（p<0.01），且随着病情的加重，其下降幅度增加，与安淑华［12］等研究一致，肺通气功能降低是哮喘的重要特征，且随着病情的加重，其肺通气功能越差；对于ECP及肺通气功能的相关性分析发现，诱导痰液内ECP含量与FVC和FEV1.0%呈负相关性（p均＜0.01），表明诱导痰液ECP含量测定可有效反映肺通气功能，提示其可作为儿童哮喘病情监测及指导治疗的指标。
综上所述，诱导痰内ECP含量检测能有效反映肺通气功能，从而判断哮喘病情的变化，可作为中重度哮喘及病情严重程度评估的临床指标，对于哮喘的临床诊断和治疗指导具有重要意义。
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