温韵洁 刘丽军 罗伟权 林斌 邓永键
【摘要】目的比较荧光定量PCR和FISH技术对肺结核诊断的敏感性和特异性。方法共收集300例明确诊断为肺结核的患者作为阳性对照组，以及收集300例健康志愿者（明确排除肺结核患者）做为阴性对照组。收集800例新收临床疑似肺结核患者做为研究组。收集该800例患者的肺活检标本以及同期的痰液标本，其中痰液进行涂片、结核杆菌分离培养以及结核杆菌DNA荧光定量PCR检测和FISH检测。比较荧光定量PCR和FISH技术对肺结核诊断阳性符合率和阴性符合率。结果
①FISH技术检测结核杆菌阳性符合率为99.3%；荧光定量PCR检测结核杆菌阳性符合率为97.3%。两者阳性符合率存在统计学差别（p=0.015）。②FISH技术检测结核杆菌阴性符合率为98.2%，荧光定量PCR技术检测结核杆菌阴性符合率为96.9%。两者阴性符合率存在统计学差别（p=0.007）。结论与荧光定量PCR比较，FISH对肺结核诊断具有较高的阳性符合率和阴性符合率。
【关键词】肺结核 荧光定量PCR 荧光标记原位杂交技术
doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2014.11.031
结核病被列为我国重大传染病之一，是严重危害人民群众健康的呼吸道传染病［1-2］。根据世界卫生组织的统计， 我国是全球 22 个结核病流行严重的国家之一，同时也是全球 27个耐多药结核病流行严重的国家之一［3］。近十余年来，随着分子生物学的高速发展，以及检测手段的提高、检测软件的不断发展，基因诊断技术作为结核病非培养诊断技术是近年来结核病诊断的一项重大突破，具有特异、敏感、快速鉴定结核病的优点。常规PCR技术、荧光定量PCR、巢式PCR等技术在结核病诊断中应用的报道屡见不鲜。但PCR技术也存在不少的局限性，如由于该技术操作复杂，往往易造成细胞前处理受损，扩增过程的非特异性，使得检测信号微弱，不易辨识，造成假阳性、假阴性结果等［4-5］。荧光标记原位杂交技术（FISH）是一种非放射性原位杂交技术，该技术的出现弥补了荧光定量PCR的不足之处，使之具有更深刻的应用价值［6-7］。因此，本研究拟初步探讨和比较荧光定量PCR技术和FISH技术对肺结核病诊断的敏感性和特异性，现报告如下。
1研究方法
1.1研究对象
患者收集时间为2013年1月~2014年1月，共收集300例明确诊断为肺结核的患者做为阳性对照组，以及收集300例健康志愿者（明确排除肺结核患者）做为阴性对照组。收集800例新收临床疑似肺结核患者做为研究组。收集该800例患者的肺活检标本以及同期的痰液标本，其中痰液进行涂片、结核杆菌分离培养以及结核杆菌DNA荧光定量PCR检测，肺活检标本经过固定、脱水、包埋制成蜡块，进行切片抗酸染色及结核杆菌FISH检测。
1.2研究方法
①探针的制备优化：根据NCBI报道的人源结核杆菌基因序列，选取结核杆菌Ag85A基因（GenBank编号：NC-000962）及IS6110基因（GenBank编号：NC-002944）作为靶序列，结合运用primer5.0、 oligo6.0 和Primer express 2.0软件，设计出两组结核杆菌特异性探针引物（引物序列具体见表1），将两组引物及其扩展产物放入NCBI作BLAST进行同源性分析，结果显示与其它基因序列异源，从而避免了杂交时非特异性的存在。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。②FISH检测流程的优化：操作方法参照《Fluorescence in Situ Hybridization Technology》(Barbara Beatty等，美国)，针对FISH技术关键步骤进行反应条件的摸索优化。③所有800例试验组人群同时还进行痰液涂片检查、痰液结核杆菌分离培养、痰液结核杆菌DNA荧光定量PCR检测。
1.3荧光定量PCR检测
使用达安基因股份有限公司的结核杆菌（TB）核酸扩增PCR荧光检测试剂盒（Cat.#DA-052），对痰液标本进行结核杆菌核酸检测，主要采用胰酶消化法对痰液标本进行消化处理，处理完成后提取结核杆菌基因组DNA，用荧光定量PCR进行结核杆菌DNA的扩增检测，操作步骤按照试剂盒的说明进行。
1.4统计分析
将痰液涂片检查、痰液结核杆菌分离培养、痰液结核杆菌DNA荧光定量PCR检测、肺组织病理标本抗酸染色、结核杆菌FISH检测结果均为阳性者定义为阳性，结果均为阴性者定义为阴性，其他情况均定义为可疑。①阳性符合率：依据上述定义，结核杆菌FISH检测的阳性符合率=结核杆菌FISH检测阳性数/所有标本检测阳性数。②阴性符合率依据上述定义，结核杆菌FISH检测的阴性符合率=结核杆菌FISH检测阴性数/所有标本检测阴性数。采用spss 17.0统计软件进行数据统计分析，定量资料采用均数±标准差表示，定性资料采用百分率表示，组间比较采用t-检验或卡方检验，p<0.05表示差别具有统计学意义。
2结果
2.1FISH技术和荧光定量PCR检测结核杆菌阳性符合率
300例明确诊断为肺结核患者，298例患者FISH检测为阳性。另外800例临床可疑为肺结核患者中，依据痰液涂片检查、痰液结核杆菌分离培养检测诊断为肺结核患者共有378例，其中375例FISH结果为阳性，因此，FISH技术检测结核杆菌阳性符合率为99.3%［（298+375）/（300+378）］。300例明确诊断为肺结核患者，290例患者荧光定量PCR检测为阳性。另外800例临床可疑为肺结核患者中，依据痰液涂片检查、痰液结核杆菌分离培养检测诊断为肺结核患者共有378例，其中370例荧光定量PCR结果为阳性，因此，荧光定量PCR检测结核杆菌阳性符合率为97.3% ［（290+370）/（300+378）］。卡方检验比较FISH技术和荧光定量PCR检测技术得阳性符合率存在统计学差别（X2=3.678，p=0.015）。
2.2FISH技术和荧光定量PCR检测结核杆菌阴性符合率
300例明确排除肺结核患者中，有5例FISH检测为阳性。另外800例临床可疑为肺结核患者中，依据痰液涂片检查、痰液结核杆菌分离培养、痰液结核杆菌DNA荧光定量PCR检测排除为肺结核患者共有422例，其中8例FISH结果为阳性，因此，FISH技术检测结核杆菌阴性符合率为98.2% ［（295+414）/（300+422）］。300例明确排除肺结核患者中，有9例荧光定量PCR检测为阳性。另外800例临床可疑为肺结核患者中，依据痰液涂片检查、痰液结核杆菌分离培养检测排除为肺结核患者共有422例，其中13例荧光定量PCR结果为阳性，因此，荧光定量PCR技术检测结核杆菌阴性符合率为96.9% ［（291+409）/（300+422）］。卡方检验比较FISH技术和荧光定量PCR检测技术得阴性符合率存在统计学差别（X2=5.065，p=0.007）。
3讨论
卫生部全国第五次结核病流行病学抽样调查结果显示，目前我国结核病年发病人数约为130万，占全球发病的14.3%，位居全球第2位。2001~ 2010年， 全国共发现和治疗肺结核患者 828 万例，其中传染性肺结核患者 450 万例［8－9］。结核病是一种慢性传染病，其发病规律和流行特点决定了在今后相当长的时期内其危害将持续存在。传统上诊断肺结核，有三种途径：①痰液及病变组织中查出结核杆菌；②结核的病理组织常规检查；③胸部X线检查，但该方法不能确诊肺结核，因为肺部其他疾病，如肺炎、肺寄生虫病、肺部肿瘤等病变也可出现类似肺结核病变的肺部X线影像学表现，单凭X线检查，许多患者会误诊误治，不但给患者造成经济上的损失，还会导致病情恶化。
荧光定量PCR技术和FISH技术是近年来新开展的用于检测肺结核的新技术，但两种技术对肺结核诊断的阳性符合率和阴性符合率是否存在差别目前未见文献报道。本研究结果表明，与传统检测方法相比，荧光定量PCR技术和FISH技术均具有较高的阳性符合率和阴性符合率［10-11］。以此同时，与荧光定量PCR技术相比较，FISH技术的阳性符合率和阴性符合率更高，差别具有统计学意义。我们认为这可能与如下因素有关［12-15］：（1）荧光定量PCR检测结核杆菌作为快速诊断技术已普遍应用于临床，具有高特异性和敏感性，由于该技术操作复杂，往往易造成细胞前处理受损，扩增过程的非特异性，使得检测信号微弱，不易辨识，造成假阳性、假阴性结果；（2）FISH技术是一种非放射性原位杂交技术，具有以下优点：①荧光试剂和探针经济、安全；②探针稳定，一次标记后可在两年内使用；③实验周期短，能迅速得到结果，特异性好，定位准确；④FISH可定位长度在1 kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当；⑤多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列；⑥针对染色体的检查既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。
综上所述，本研究结果表明，与传统检测方法以及荧光定量PCR比较，FISH对肺结核诊断具有较高的阳性符合率和阴性符合率，值得临床推广。
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