韩长志
（西南林业大学林学院／云南省森林灾害预警与控制重点实验室，昆明６５０２２４）
摘要：以酿酒酵母中已经报道的５个典型ＰＩＴＰ序列为基础，对炭疽菌属蛋白质数据库进行Ｂｌａｓｔｐ比对以及教育期刊网 http://www.jyqkw.com
关键词 搜索，并通过ＳＭＡＲＴ保守结构域分析，明确该菌含有４个典型的ＰＩＴＰ；同时，通过对上述氨基酸序列进行疏水性、细胞信号肽、跨膜区结构域、亚细胞定位以及二级结构等生物信息学分析，并与其他物种中１５个同源序列进行遗传关系比较分析，以期为深入开展希金斯炭疽菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｈｉｇｇｉｎｓａｎｕｍ Ｓａｃｃ．）ＰＩＴＰ的功能研究打下理论基础，同时，也为进一步开展其他炭疽菌的研究提供重要的理论指导。
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关键词 ：希金斯炭疽菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｈｉｇｇｉｎｓａｎｕｍ Ｓａｃｃ．）；磷脂酰肌醇转移蛋白质；生物信息学分析；遗传关系；炭疽菌属
中图分类号：Ｑ８１文献标识码：A文章编号：0439－８114（２０15）03－0７１３-0４
希金斯炭疽菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｈｉｇｇｉｎｓａｎｕｍ Ｓａｃｃ．）属于炭疽菌属真菌，其可以侵染如菜心、小油菜、结球甘蓝、羽衣甘蓝、大白菜、萝卜等多种十字花科蔬菜作物而引起炭疽病，是一类重要的世界性植物真菌病害，现主要分布于美国、中国、日本以及印度等国［１－３］。在我国，由该病菌侵染菜心引起的炭疽病是菜心上最常见和发生最严重的病害之一［４］。该病害对广东省菜心种植地区具有重要的影响，不仅降低了菜心的产量，对菜心的品质也产生了较大影响［５，６］。国内外对该病菌的研究主要集中在生物学特性、生防菌筛选以及遗传转化等方面［７，８］，同时，随着该病菌基因组序列的释放［９］，林春花等［１０］对其开展了ＭＡＰＫ途径相关基因的找寻及信号通路简图的绘制工作。
磷脂酰肌醇转移蛋白质（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＰＩＴＰ）是一类广泛存在于真核生物细胞中具有一个疏水性强的水溶性蛋白质载体，其功能在于把一分子的脂类物质包裹在疏水腔内，使包裹的脂类物质远离细胞质内水溶性的环境，从而实现脂类物质在不同膜间定向转运［１１］。该蛋白质通过参与调节脂类代谢途径和胞内进程，从而在多个复杂的生理发育过程中发挥重要作用［１２］。目前，认为在肌醇磷脂代谢途径中发挥重要作用的有ＰＩＴＰ－ＰＬＣ（磷脂酶Ｃ）途径、ＣＤＰ（胞嘧啶核苷二磷酸）－胆碱生物合成途径［１３，１４］。学术界对于植物中所含有的ＰＩＴＰ有较多报道，如大豆、日本百脉根、拟南芥以及棉花等，而对于真菌ＰＩＴＰ的研究报道较为少见。
本研究以酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓ２８８ｃ）中已经报道的５个典型ＰＩＴＰ氨基酸序列为基础，通过在炭疽菌属蛋白质数据库中进行Ｂｌａｓｔｐ比对分析以及教育期刊网 http://www.jyqkw.com
关键词 搜索，获得与酿酒酵母ＰＩＴＰ同源的Ｃ． ｈｉｇｇｉｎｓａｎｕｍ序列，并通过保守结构域分析、疏水性分析、二级结构预测等生物信息学分析，以期明确该菌中所存在的ＰＩＴＰ数量、疏水性特点、结构特征以及细胞定位情况，同时，基于上述ＰＩＴＰ氨基酸序列，在美国国家生物信息中心（ＮＣＢＩ）在线进行同源序列搜索，通过遗传关系分析，以期为进一步开展其他炭疽菌中ＰＩＴＰ的研究提供理论指导。
１材料与方法
１．１材料
根据酿酒酵母中含有的５个ＰＩＴＰ（Ｓｅｃ１４、Ｐｄｒ１６、Ｐｄｒ１７、Ｓｆｈ５和ＣＳＲ１）氨基酸序列，利用炭疽菌属蛋白质数据库在线进行Ｂｌａｓｔｐ比对［１５］，所有参数均选择默认值，获得Ｃ． ｈｉｇｇｉｎｓｉａｎｕｍ中所含有的典型ＰＩＴＰ，同时，通过输入“Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ－ｔｒａｎｓｆｅｒ－ｐｒｏｔｅｉｎ”、“ＰＩＴＰ”教育期刊网 http://www.jyqkw.com
关键词 ，在上述数据库中进行ＰＩＴＰ检索；另外，利用ＮＣＢＩ明确该菌中ＰＩＴＰ蛋白质登录号信息（表１）。
１．２方法
１．２．１ 保守结构域预测利用ＳＭＡＲＴ网站在线分析ＰＩＴＰ所具有的保守结构域特征。
１．２．２蛋白质疏水性预测利用Ｐｒｏｔｓｃａｌｅ程序［１６］对ＰＩＴＰ进行疏水性测定。
１．２．３蛋白质转运肽及信号肽预测转运肽的预测利用ＴａｒｇｅｔＰ １．１ Ｓｅｒｖｅｒ进行在线分析［１７］，信号肽预测则是利用ＳｉｇｎａｌＰ ３．０ Ｓｅｒｖｅｒ［１８］进行在线分析。
１．２．４蛋白质二级结构及跨膜区结构预测对蛋白质二级结构预测采用ＰＨＤ［１９］进行在线分析。同时，对其ＰＩＴＰ的跨膜区结构进行预测，利用ＴＭＨＭＭ Ｓｅｒｖｅｒ ｖ． ２．０进行在线分析［１８］。
１．２．５亚细胞定位分析对Ｃ． ｈｉｇｇｉｎｓｉａｎｕｍ中ＰＩＴＰ进行亚细胞定位分析，利用ＰｒｏｔＣｏｍｐ ｖ.９．０进行在线分析［２０］。
１．２．６系统进化树构建在ＮＣＢＩ中，以Ｃ． ｈｉｇｇｉｎｓｉａｎｕｍ中所含ＰＩＴＰ氨基酸序列为基础，在线进行Ｂｌａｓｔｐ同源搜索，获得来自不同物种的同源蛋白质序列。对所获得的同源序列，利用Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ软件［２１］进行多重比对分析，随后利用ＭＥＧＡ ５．２．２软件［２２］构建系统进化树，采用邻近法构建系统发育树，各分支之间的距离计算采用ｐ－ｄｉｓｔａｎｃｅ模型，系统可信度检测采用自举法重复１ ０００次进行。
２结果与分析
２．１希金斯炭疽菌含有４个典型的ＰＩＴＰ
对酿酒酵母中典型的５个ＰＩＴＰ进行ＳＭＡＲＴ分析，明确上述ＰＩＴＰ均具有ＳＥＣ１４保守域结构，除Ｓｆｈ５外，其他４个还具有一个存在于氨基酸序列Ｎ端，且尚未知功能的ＣＲＡＬ＿ＴＲＩＯ＿Ｎ保守域结构，同时，上述典型ＰＩＴＰ所含氨基酸的大小范围为343～469 ａａ。
对炭疽菌属进行Ｂｌａｓｔｐ比对分析，除Ｓｅｃ１４、ＣＳＲ１具有同源的序列外，其他３个（Ｐｄｒ１６、Ｐｄｒ１７、Ｓｆｈ５）在希金斯炭疽菌中均没有发现其同源序列。同时，结合教育期刊网 http://www.jyqkw.com
关键词 搜索，结果表明，Ｃ． ｈｉｇｇｉｎｓｉａｎｕｍ中存在４个与酵母中ＰＩＴＰ同源性较高序列，其ＩＤ分别为ＣＨ０６３＿００８１５．１、ＣＨ０６３＿０６６７３．１、ＣＨ０６３＿０１０１４．１、ＣＨ０６３＿１０６３８．１。根据ＳＭＡＲＴ保守域分析，结果显示，上述４个蛋白质序列均含有典型ＰＩＴＰ所具有的ＳＥＣ１４保守域（图１），按照氨基酸长度，重新对上述希金斯炭疽菌中的典型ＰＩＴＰ进行命名，分别为ＣｈＰＩＴＰ１、ＣｈＰＩＴＰ２以及ＣｈＰＩＴＰ３、ＣｈＰＩＴＰ４（表１）。
２．２蛋白质疏水性预测
疏水性分析结果显示，ＣｈＰＩＴＰ１中位于２９１位的Ｅ，亲水性最强，数值达到－１．９９５，而位于１７９位的Ｄ，亲水性最弱，为０．９２１；ＣｈＰＩＴＰ２中位于３１４、３１７位的Ｑ、Ｗ，亲水性最强，而位于２４８位的Ｔ，亲水性最弱；ＣｈＰＩＴＰ３中位于６２位的Ｔ，亲水性最强，而位于２９４位的Ｗ，亲水性最弱；ＣｈＰＩＴＰ４中位于６６位的Ｖ，亲水性最强，而位于２５５位Ａ，其亲水性最弱（表２，图２）。同时，发现ＣｈＰＩＴＰ１、ＣｈＰＩＴＰ２、ＣｈＰＩＴＰ３、ＣｈＰＩＴＰ４这４个典型ＰＩＴＰ尽管在亲水性最强氨基酸残基位置和数值、疏水性最强氨基酸残基位置和数值、疏水性氨基酸残基数值总和以及亲水性氨基酸残基数值总和等方面的结果不尽相同，但均属于亲水性蛋白质，这与通过理化性质分析中的ＧＲＡＶＹ计算所得结果一致。
２．３转运肽及信号肽特征
通过分析，ＣｈＰＩＴＰ１、ＣｈＰＩＴＰ２、ＣｈＰＩＴＰ３、ＣｈＰＩＴＰ４具有分泌途径信号肽的可能性最大，其预测值分别为０．９４８、０．９６１、０．８５４、０．９２４（表３）。经过ＳｉｎｇｎａｌＰ ３．０ Ｓｅｒｖｅｒ在线分析，上述４个ＰＩＴＰ均不含有明显的信号肽序列。
２．４二级结构及跨膜结构域预测
二级结构预测结果显示，４个ＰＩＴＰ均含有α螺旋、β折叠、无规卷曲等二级结构，其中，ＣｈＰＩＴＰ１、ＣｈＰＩＴＰ３、ＣｈＰＩＴＰ４所含α螺旋比例较高，分别为４９％、５１％、４６％，而在ＣｈＰＩＴＰ２中，其所含无规卷曲结构所占比例较高，为４４％；对于β折叠结构，ＣｈＰＩＴＰ１、ＣｈＰＩＴＰ２、ＣｈＰＩＴＰ３、ＣｈＰＩＴＰ４所含比例均较低（图３）。
通过ＴＭＨＭＭ Ｓｅｒｖｅｒ ｖ． ２．０在线分析，上述４个ＰＩＴＰ均不含有典型的跨膜结构域，然而，通过二级结构预测发现ＣｈＰＩＴＰ４在２８１到３１１位氨基酸之间存在一个跨膜结构域，两者预测不同，有待于今后通过试验进一步验证。
２．５亚细胞定位分析
通过ProtComp v. 9.0在线分析，结果表明，４个典型的ＰＩＴＰ亚细胞定位情况不尽相同，其中，ＣｈＰＩＴＰ１、ＣｈＰＩＴＰ２定位于高尔基体中，而ＣｈＰＩＴＰ３定位于线粒体上，ＣｈＰＩＴＰ４定位于细胞质中（表４）。
２．６遗传关系
在ＮＣＢＩ中，通过对Ｃ． ｈｉｇｇｉｎｓｉａｎｕｍ ４个典型ＰＩＴＰ序列进行Ｂｌａｓｔｐ搜索，分别获得ＣｈＰＩＴＰ１、ＣｈＰＩＴＰ２、ＣｈＰＩＴＰ３、ＣｈＰＩＴＰ４的同源序列，选择同源性较高的１５条序列进行聚类分析，结果显示，上述４个ＰＩＴＰ与其各自同源序列分别聚在一起，而彼此之间并未聚在一起；就Ｃ． ｈｉｇｇｉｎｓｉａｎｕｍ中每一个ＰＩＴＰ与其他物种同源序列之间的亲缘关系而言，ＣｈＰＩＴＰ１与禾谷炭疽菌中的ＥＦＱ２７５１１．１、西瓜炭疽病菌中的ＥＮＨ７６６６６．１之间亲缘关系较近；ＣｈＰＩＴＰ２与大丽轮枝菌中的ＥＧＹ１７１７７．１、黑白轮枝菌中的ＸＰ００３００5673．１亲缘关系较近；ＣｈＰＩＴＰ３与Ｃ． ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ中的ＥＦＱ２９４８２．１之间的亲缘关系较近；ＣｈＰＩＴＰ４与Ｃ． ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ中的ＥＦＱ３０４９８．１之间的亲缘关系较近（图４），这与前期关于禾谷炭疽菌ＰＩＴＰ的亲缘关系研究所得结果一致［２３］。
３小结与讨论
Ｃ． ｈｉｇｇｉｎｓａｎｕｍ可侵染菜心、白菜等众多十字花科蔬菜引起炭疽病，不仅影响蔬菜的产量，也对其品质造成重要影响。深入开展该病菌的致病因子研究，有助于进一步开发以致病因子为作用靶标的防治药剂。２０１２年，随着该菌全基因组序列的释放［９］，为学术界对其开展致病因子研究提供了便利条件。
目前，已经明确ＰＩＴＰ参与真核生物体内众多生理功能以及信号转导过程，然而，对于真菌中ＰＩＴＰ的报道尚不多见。本研究基于酿酒酵母中已经报道的５个典型ＰＩＴＰ序列，在炭疽菌属蛋白质数据库中，利用Ｂｌａｓｔｐ比对以及教育期刊网 http://www.jyqkw.com
关键词 搜索，同时，基于ＳＭＡＲＴ保守域分析，共获得Ｃ． ｈｉｇｇｉｎｓａｎｕｍ ４个典型的ＰＩＴＰ。利用生物信息学分析，初步明确了上述４个典型ＰＩＴＰ在细胞信号肽、疏水性、亚细胞定位、跨膜结构域以及二级结构等方面具有的特征，为深入解析Ｃ． ｈｉｇｇｉｎｓａｎｕｍ ＰＩＴＰ的功能研究打下坚实基础。与此相似，通过上述方法，也获得了Ｃ． ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ中含有３个ＰＩＴＰ，并明确上述ＰＩＴＰ具有的相关特征。在炭疽菌属病菌中上述２种全基因组测序已经完成，而大多数危害农、林业生产的炭疽菌的全基因组测序尚未完成，因此，本研究基于Ｃ． ｈｉｇｇｉｎｓａｎｕｍ中典型ＰＩＴＰ，通过遗传关系比较分析，可为进一步开展其他炭疽菌属真菌中ＰＩＴＰ研究提供重要的理论指导。
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