齐 麟１，李 军２，向志明３，余英才４
（１．铁道警察学院，郑州 ４５００５３； ２．聊城大学药学院，山东 聊城 ２５２０００； ３．中国科学院南海海洋研究所，广州 ５１０３０１；４．江西中医药大学生物化学教研室，南昌 ３３０００４）
摘要：通过构建斑马鱼（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）ＳＡＡ原核表达载体，在大肠杆菌（E.coli）ＴＢ１中诱导表达并纯化获得了斑马鱼ＳＡＡ融合蛋白，将纯化的斑马鱼ＳＡＡ蛋白免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，制备了特异性多克隆抗血清，并研究了斑马鱼ＳＡＡ融合蛋白与细菌的结合能力及检测了抗体效价。结果表明，纯化的斑马鱼融合ＳＡＡ蛋白能够与５种细菌直接结合，血清效价达到１∶２ ０００以上。
教育期刊网 http://www.jyqkw.com
关键词 ：斑马鱼（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）；血清淀粉样蛋白Ａ；原核表达；抗体制备；菌结合
中图分类号：Ｑ７８９ 文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０15）02－0382-03
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.031
血清样淀粉Ａ（Ｓｅｒｕｍ ａｍｙｌｏｉｄ Ａ， ＳＡＡ）为高度异质性蛋白［１］，因与一系列疾病相关而成为病理学研究的热点。ＳＡＡ基因的多态性是淀粉样病变的高危因素，持续高水平ＳＡＡ是淀粉样病变发生的前提条件［２］。除此之外，ＳＡＡ与胃癌［３］、直肠癌［４］、胰腺癌［５］、肺癌［６］和绒毛膜癌［７］等恶性肿瘤呈正相关，并将ＳＡＡ作为癌症临床常规检查的非特异性肿瘤标志物以及手术后康复程度的指标是可行的。人源ＳＡＡ可以通过ＮＦ－κＢ信号通路诱导细胞间黏附分子１（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ １， ＩＣＡＭ－１）的表达而募集白细胞［８］。本研究中在克隆获得全长斑马鱼（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）ＳＡＡ的基础上［９］，构建融合表达载体，在大肠杆菌TB1中表达斑马鱼ＳＡＡ并进行纯化，将纯化蛋白进行菌结合试验并免疫Balb/c小鼠制备了特异性多克隆抗体，为后续免疫及肿瘤病理学试验打下基础。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
１．１．１ 载体与菌种 原核表达载体ｐＭａｌ－ｃ２ｘ、大肠杆菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）表达宿主菌ＴＢ１和Ａｍｙｌｏｓｅ Ｒｅｓｉｎ多糖树脂购自Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ公司；ｐＧＥＭ－Ｔ ｖｅｃｔｏｒ购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；大肠杆菌ＤＨ５α、野生型大肠杆菌Ｋ１２、副溶血弧菌（Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、溶澡酸弧菌（Ｖ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）、金黄色葡萄球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）和表皮葡萄球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）均为铁道警察学院生化快速鉴别实验室常规保种。
１．１．２ 试剂 琼脂糖胶回收试剂盒和小量质粒提取试剂盒为Ｏｍｅｇａ公司产品；Ｔ４ ＤＮＡ连接酶、Ｔａｑ酶、ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ、限制性内切酶ＥｃｏＲⅠ和ＸｂａⅠ为宝生物工程（大连）有限公司产品；蛋白Ｍａｒｋｅｒ为Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司产品；碱性磷酸酶羊抗鼠ＩｇＧ购自美国安玛西亚公司；ＮＣ膜购自ＰＡＬＬ公司；其他试剂均为国产分析纯。
１．２ 原核表达载体pMal-c2x-SAA的构建
使用Ｐｒｉｍｅｒ ｐｒｅｍｉｅｒ ５．０软件设计上、下游引物，以ｐＧＥＭ－Ｔ－ＳＡＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，其中上游引物序列：５′－ＴＴＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧ －３′，下游引物序列：５′－ＴＴＴＴＣＴＡＧＡＴＡＴＧＧＧＣＡＧＧ
ＣＣＴＴＴＡ－３′。ＰＣＲ反应程序为：９４ ℃预变性５ ｍｉｎ；９４ ℃变性２０ ｓ，５６ ℃退火３０ ｓ，７２ ℃延伸３０ ｓ，共３０个循环；７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。将ＰＣＲ扩增产物经琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化后和ｐＭａｌ－ｃ２ｘ空载体质粒进行ＥｃｏＲⅠ和ＸｂａⅠ双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化后于１６ ℃连接过夜，并将连接产物转化原核表达宿主菌ＴＢ１，－８０ ℃保菌。
１．３ 重组质粒ｐＭａｌ－ｃ２ｘ－ＳＡＡ的诱导表达及纯化
取“１．２”中的菌液０．５ ｍＬ接种到５ ｍＬ含氨苄青霉素的新鲜ＬＢ液体培养基中，３７ ℃过夜培养后，转接到５００ ｍＬ的新鲜培养基中，继续３７ ℃培养至ＯＤ６００ ｎｍ＝０．６，加入０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ诱导３ ｈ以上，以１２％的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析其表达后利用Ａｍｙｌｏｓｅ Ｒｅｓｉｎ多糖树脂来纯化重组蛋白。
１．４ 斑马鱼ＳＡＡ蛋白的菌结合试验
将获得的斑马鱼ＳＡＡ纯化蛋白用于细菌结合试验，具体操作见文献［１０］。
１．５ 斑马鱼ＳＡＡ蛋白抗鼠血清制备
取１００ μｇ纯化的斑马鱼ＳＡＡ融合蛋白进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，切下目的蛋白质条带，以去离子水反复漂洗，去除凝胶上的甲醇和冰醋酸，以ｐＨ ７．４的ＰＢＳ缓冲液４ ℃浸泡过夜。于冰浴中用研钵研磨直至悬浮液中的凝胶颗粒细小而均匀，加入等体积的弗氏佐剂，继续研磨或用注射器反复抽打使完全乳化。将１ ｍＬ用弗氏完全佐剂乳化的抗原溶液通过腹腔注射接种发育良好的纯种Ｂａｌｂ／ｃ小鼠体内做为基础免疫，基础免疫后１４ ｄ进行加强免疫。注射间隔周期为７ ｄ，加强注射所用的抗原溶液用弗氏不完全佐剂进行乳化。加强免疫４次后采用传统摘除眼球取血法采集Blab/c小鼠血液。取出的血液３７ ℃保温１ ｈ后，４ ℃静置过夜，５ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ后，取上清－８０ ℃分装保存。
１．６ 斑马鱼ＳＡＡ蛋白抗鼠血清效价的测定
用ＰＢＳ缓冲液将抗鼠血清进行稀释，稀释梯度依次为１∶１００、１∶２００、１∶５００、１∶１ ０００、１∶２ ０００、１∶３ ０００。取ＮＣ膜用ＰＢＳＴ缓冲液浸泡５ ｍｉｎ， 晾干，取纯化的蛋白１ μｇ点于膜上，用含５％脱脂奶粉的ＰＢＳＴ 缓冲液３７ ℃封闭１ ｈ，ＰＢＳＴ缓冲液洗涤１０ ｍｉｎ（重复３次）；将膜分别用封闭液稀释的抗血清３７ ℃孵育１ ｈ，ＰＢＳＴ缓冲液洗涤１０ ｍｉｎ（重复３次）；用羊抗鼠ＩｇＧ为二抗，３７ ℃哺育１ ｈ，ＰＢＳ缓冲液洗涤１０ ｍｉｎ（重复３次），ＤＡＢ显色。
２ 结果与分析
２．１ 原核表达载体ｐＭａｌ－ｃ２ｘ－ＳＡＡ的构建
使用载体构建的特异性引物进行菌落ＰＣＲ扩增，对ＰＣＲ扩增产物进行１．２％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图１所示。由图１可以看出，挑选的５个克隆中有４个大小约３６０ ｂｐ，与预期大小相符，表明成功构建ｐＭａｌ－ｃ２ｘ－ＳＡＡ原核表达载体。
２．２ ＳＡＡ蛋白的表达与纯化
将融合表达载体ｐＭａｌ－ｃ２ｘ－ＳＡＡ质粒转化到 Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＴＢ１，用０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ 的ＩＰＴＧ ３７ ℃分别诱导３、６ ｈ后，菌体用１２％的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析，结果如图２所示。由图２可以看出，在５３ ｋｕ附近有明显的蛋白条带出现，与预期大小相同，并利用Ａｍｙｌｏｓｅ Ｒｅｓｉｎ多糖树脂来纯化了重组蛋白，获得较为专一的蛋白条带。
２．３ 斑马鱼ＳＡＡ蛋白菌结合试验结果
使用纯化的ＳＡＡ融合蛋白与３种革兰氏阴性菌（野生型大肠杆菌Ｋ１２、副溶血弧菌、溶澡酸弧菌）以及２种革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌）分别进行结合试验，以诱导ｐＭａｌ－ｃ２ｘ空载体获得的融合蛋白为对照，结果如图３所示。斑马鱼ＳＡＡ具有广谱的菌结合能力，与上述５种细菌都能结合。
２．４ 斑马鱼ＳＡＡ抗小鼠多克隆抗体效价的测定结果
取纯化后的重组斑马鱼ＳＡＡ蛋白对小鼠进行皮下免疫，经过４次免疫后，从兔子耳静脉取血制备血清，用斑点酶联免疫吸附试验（ＤＯＴ－ＥＬＩＳＡ）测定抗血清效价。由图4可知，鼠抗斑马鱼ＳＡＡ血清的效价达到１∶２ ０００以上。
３ 小结与讨论
斑马鱼ＳＡＡ蛋白具有广谱的菌结合能力，对本试验所选取的５种细菌均表现出很强的吸附能力。哺乳动物ＳＡＡ蛋白一般只能对革兰氏阴性菌有结合能力，对革兰氏阳性菌无结合能力。哺乳动物的免疫系统比鱼类复杂得多，对不同种类的细菌表现出不同的免疫机制。斑马鱼属于进化地位较低等脊椎动物，ＳＡＡ蛋白可能担负起对整个细菌的识别，而在哺乳动物中，ＳＡＡ蛋白功能可能被弱化和部分分离，进化压力胁迫对ＳＡＡ蛋白功能产生了较大的影响。
教育期刊网 http://www.jyqkw.com
参考文献：
［１］ 朱 华，王 娟，林 燕，等．血清淀粉样蛋白Ａ的研究进展［Ｊ］． 心血管病学进展，２００７，２８（１）：１１３－１１５．
［２］ ＣＩＧＮＩ Ａ， ＬＥＤＤＡ Ｆ， ＳＡＴＴＡ Ａ Ｅ． Ａ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃａｓｅ ｏｆ ｒｅｎａｌ ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ ｗｉｔｈ ａ ｒａｒｅ ｃｏ－ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｆ ２ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｓｅｐａｒａｔｅ ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｆｅｖｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ［Ｊ］． Ｊ Ｎｅｐｈｒｏｌ，２００６，１９： ５４３－５４９．
［３］ ＲＯＳＥＮＴＨＡＬ Ｃ Ｊ， ＳＵＬＬＩＶＡＮ Ｌ Ｅ．Ｓｅｒｕｍ ａｍｙｌｏｉｄ Ａ ｔｏ ｍｏｎｉｔｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ， １９７９，９１： ３８３－３９０．
［４］ ＧＬＯＪＮＡＲＩＣ Ｌ， ＣＡＳＬ Ｍ Ｔ， ＳＩＭＩＣ Ｄ， ｅｔ ａｌ． Ｓｅｒｕｍ ａｍｙｌｏｉｄ Ａ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＳＡＡ） ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ［Ｊ］． Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ Ｌａｂ Ｍｅｄ，２００１， ３９： １２９－１３３．
［５］ ＹＯＫＯＩ Ｋ， ＳＨＩＨ Ｌ Ｃ， ＫＯＢＡＹＡＳＨＩ Ｒ， ｅｔ ａｌ．Ｓｅｒｕｍ ａｍｙｌｏｉｄ Ａ ａｓ ａ ｔｕｍｏｒ ｍａｒｋｅｒ ｉｎ ｓｅｒａ ｏｆ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ ｈｕｍａｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］． Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ， ２００５，２７： １３６１－１３６９．
［６］ ＬＩＵ Ｄ Ｈ， ＷＡＮＧ Ｘ Ｍ， ＺＨＡＮＧ Ｌ Ｊ． Ｓｅｒｕｍ ａｍｙｌｏｉｄ Ａ ｐｒｏｔｅｉｎ： A ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔａｇｅ ｏｆ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］． Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｓｃｉ， ２００７，２０： ３３－４０．
［７］ ＫＯＶＡＣＥＶＩＣ Ａ， ＨＡＭＭＥＲ Ａ， ＳＵＮＤＬ Ｍ，ｅｔ ａｌ． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ａｍｙｌｏｉｄ Ａ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ ａｎｄ ｆｅｔａｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ－ｌｉｋｅ ｃｈｏｒｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，２００６，５８０： １６１－１６７．
［８］ ＭＵＬＬＡＮ Ｒ Ｈ， ＢＲＥＳＮＩＨＡＮ Ｂ， ＧＯＬＤＥＮ－ＭＡＳＯＮ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ａｃｕｔｅ－ｐｈａｓｅ ｓｅｒｕｍ ａｍｙｌｏｉｄ Ａ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ， ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ， ａｎｄ ｍａｔｒｉｘ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｎ ＮＦ－κＢ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］． Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ，２００６，５４（１）： １０５－１１４．
［９］ 齐 麟，向志明，张 彤．斑马鱼ＳＡＡ基因克隆及表达分析［Ｊ］． 河南师范大学学报（自然科学版），２０１１，３９（５）：１３４－１３６．
［１０］ 吴丽娜．高等动物避免病原菌作用其血清肌酸激酶分子机制的研究［Ｄ］．广州：中山大学，２００８．
（责任编辑 屠 晶）
