刘庆1,2，朱世杨1,2，张小玲1,2，朱婷婷2，罗天宽1,2
（1温州市农业科学研究院，浙江温州325006；2温州科技职业学院，浙江温州325006）摘要：为给‘瓯雪60 天’制种母本9901A（隐性核不育系）的快速繁殖提供依据，研究了花椰菜花球采收期、20 cm抽薹期、开花期不同部位取材外植体对诱导培养的影响。结果表明：不同生育阶段不同部位取材外植体的愈伤组织诱导率均为100%。不同阶段不同部位外植体诱导出芽效果存在差异，以开花期花托诱导出芽数量最多，采收期3 mm厚花枝诱导出芽数量次之，20 cm抽薹期则诱导不出芽。4℃低温处理1 天采收期花球表面花枝的诱导效果较好，而低温处理3、7 天的诱导效果有所降低。
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关键词 ：外植体选取；低温处理；花椰菜不育系；诱导培养
中图分类号：S635.3 文献标志码：A 论文编号：2014-0205
基金项目：温州市科技计划项目“瓯雪60 天花椰菜制种技术研究及开发利用”(N20100060)，“松花型花椰菜种质资源创新与新品种选育研究”(N20110001)。
第一作者简介：刘庆，男，1979 年出生，浙江苍南人，助研，本科，主要从事花椰菜育种研究。通信地址：325006 温州市六虹桥路1000 号温州市农业科学研究院，Tel：0577-86181080，E-mail：35147127@.com。
通讯作者：朱世杨，男，1982 年出生，江苏如皋人，讲师，硕士，主要从事花椰菜育种与植物生理研究。通信地址：325006 温州市六虹桥路1000 号温州市农业科学研究院，Tel：0577-86181080，E-mail：zhushiyang2000@163.com。
收稿日期：2014-03-10，修回日期：2014-07-05。
0 引言
‘瓯雪60 天’是温州市农业科学研究院利用花椰菜隐性细胞核雄性不育系9901A 为母本，优良自交系9908 为父本，培育而成的花椰菜杂交组合。该组合于2009 年12 月通过浙江省非主要农作物品种审定委员会审定，审定编号为浙（非）审蔬20090016。该组合已在浙江温州、四川成都等地方大面积推广应用。由于‘瓯雪60 天’制种母本9901A 系隐性细胞核雄性不育系，不易通过种子繁殖母本进行制种，限制了其大规模的推广应用。应用植物组织培养技术可以繁殖保持花椰菜的优良特性。前人已经开展了一些花椰菜组织培养方面研究。如吴丽芳等[1]以花球为外植体研究了花椰菜不育系组培快繁和无糖生产技术；张小玲等[2]以未受精子房、花托、花序轴为外植体进行了花椰菜离体培养诱导成苗研究；黄俊轩等[3]以花椰菜叶片为外植体研究了其离体再生技术；许端祥等[4]则以腋芽为材料开展了花椰菜自交不亲和系的组培快繁研究。然而，关于花椰菜隐性细胞核雄性不育系不同生育阶段不同部位外植体诱导培养的研究尚未见报道。为此，笔者以‘瓯雪60 天’核不育系母本9901A 为材料，开展不同生育阶段不同部位取材外植体对诱导培养影响的研究，以为‘瓯雪60 天’制种母本快速繁殖提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验设计
1.1.1 外植体选取处理以‘瓯雪60 天’母本9901A 花球采收期（2010 年12 月30 日）、20 cm抽薹期（2011 年1月21 日）、开花期（2011 年3 月10 日）3 个生育阶段不同部位外植体为接种材料，设置处理：（1）采收期花球表面3 mm厚花枝；（2）20 cm 抽薹期由上端往下数的顶端以及第一、二、三分枝（图1 左）；（3）开花期由顶端往下数的花托、花柄以及第一、二分枝（图1 右）。
1.1.2 外植体低温处理以‘瓯雪60 天’母本9901A 采收期花球表面3 mm厚花枝为接种材料，于4℃冰箱中分别低温处理0、1、3、7 天，然后供接种用。
1.2 诱导培养
1.2.1 诱导培养基配方所用培养基为MS+2,4-D0.01mg/L+BA 1 mg/L +NAA 0.001 mg/L，蔗糖浓度为3.0%，琼脂浓度为0.7%，pH 5.8。
1.2.2 无菌接种诱导培养取上述外植体无菌接种，然后置于培养室（温度24±2℃，每天光照12 h，黑暗12 h）中诱导培养。接种时将外植体切成2~3 mm，每瓶接种5 小块，每处理接种30 瓶。50 天后，随机挑选4 瓶，统计愈伤组织诱导率和诱导芽数。
愈伤组织诱导率=(带有愈伤组织外植体数/接种外植体数)×100%；
诱导芽数=诱导出的芽数/接种外植体数。
1.3 数据分析
数据用Excel分析软件进行统计和分析。
2 结果与分析
2.1 外植体选取时期和部位对花椰菜诱导培养的影响
由表1 可知，‘瓯雪60 天’母本9901A花球采收期、20 cm抽薹期、开花期3 个生育阶段不同部位外植体接种后愈伤组织诱导率均100%。但是，不同生育阶段不同取材部位外植体的诱导出芽数存在差异。其中，采收期3 mm厚花枝诱导芽数为3 个/外植体；20 cm抽苔期各部位取材均诱导不出芽；开花期花托、花柄以及第一、二分枝诱导芽数分别为3.7、2.7、2.7、1.2 个/外植体。
2.2 外植体低温处理时间对花椰菜诱导培养的影响
由表2 可以看出，适宜时间的4℃低温处理可以提高花椰菜采收期花球表面3 mm厚花枝的诱导效果。其中4℃低温处理0、1、3 天，愈伤组织诱导率均为100%；4℃低温处理7 天，愈伤组织诱导率则降为75%。4℃低温处理0、1、3、7 天，诱导芽数分别为3、5、2.5、1 个/外植体。说明，外植体4℃低温处理1 天诱导效果最佳。
3 结论与讨论
‘瓯雪60 天’母本9901A 为隐性核基因控制的不育系，没有保持系，无法自身繁殖，用组织培养方法可以在短期内扩繁获得大量不育系种苗，满足生产上制种的需要[5]。诱导培养是花椰菜组织培养的一个关键阶段，所用外植体可以是未受精子房、花托、花序轴、叶片、叶柄、腋芽、茎节段、花球等组织器官，但不同外植体及其选取时期与部位对诱导效果产生的影响可能不同[1-4,6-8]。因此，对‘瓯雪60 天’母本9901A 不同生育阶段不同部位取材外植体诱导培养研究具有重要的意义。
本研究发现，‘瓯雪60 天’母本花球采收期、20 cm抽薹期、开花期3 个生育阶段不同部位取材外植体的愈伤组织诱导率均为100%。说明取材时期和部位对花椰菜愈伤组织诱导影响不大。这与李曙轩和裘文达在‘80 天’花椰菜花球组织或花序柄组织培养中发现有90%~100%的切段都能形成愈伤组织的结论基本一致[8]。但是，花椰菜诱导出芽效果因外植体取材时期和部位而异，其中开花期花托诱导出芽效果最好，采收期3 mm厚花枝效果次之，而20 cm抽苔期则诱导不出芽。说明，开花期花托是‘瓯雪60 天’母本诱导培养的理想材料。这与张小玲等以花椰菜‘圆叶80 天’和‘青叶100 天’为材料，研究发现花椰菜诱导出芽数量以花托为最多的结果是一致的[2]。
低温处理能够促进植物诱导培养。本研究还发现，花椰菜采收期花球外植体4℃低温处理1 天，诱导芽数最多，而4℃低温处理3、7 天愈伤组织诱导率和芽数均有所降低。说明，4℃低温处理1 天诱导效果最佳，也表明低温处理能够促进愈伤组织诱导及芽分化。这与前人在结苜蓿[9]、缕草[10]、拟南芥菜[11]、小麦[12]、马铃薯[13]、油茶[14]、胡麻[15]等研究结果有所类似，但这一结果的具体作用原理还有待进一步的探讨研究。在实际生产中，可以考虑将母本采收期割球采下的花枝4℃贮藏后接种诱导培养，既能提高诱导芽数，又可提高割球采下花枝的利用价值，而不会影响单株花数降低种子产量；同时可提早进入增值扩繁提高组培效率。
综上所述，‘瓯雪60 天’母本花球采收期、20 cm抽薹期、开花期不同部位取材外植体的愈伤组织诱导率均为100%。但是诱导出芽效果以开花期花托最好，采收期3 mm 厚花枝次之，20 cm 抽薹期诱导不出芽。4℃低温处理1 天可以提高采收期花球表面花枝诱导效果，但低温处理3、7 天后诱导效果有所降低。本试验结果是基于单个花椰菜不育系品种诱导培养的，研究结果是否适用于其它花椰菜不育系材料尚需进行验证。此外，诱导培养仅仅是花椰菜组织培养的一个阶段，还需对其继代培养和生根培养做进一步的探索。
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参考文献
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