刘达玉１，王慧超２，郑林用３，戴 玄２，李宗堂４，陈今朝２
（１．成都大学生物产业学院，成都 ６１０１０６；２．长江师范学院生命科学与技术学院，重庆 ４０８１００；３．四川省农业科学院，成都 ６１００６６；４．成都榕珍菌业有限公司，成都 ６１１７３３）
摘要：对武陵山羊肚菌（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）的液体培养条件、培养基进行了优化。结果表明，最适液体培养条件为ｐＨ ６．０、培养液装量１００ ｍＬ／２５０ ｍＬ、接种量８％、温度２５ ℃、摇床转速１８０ ｒ／ｍｉｎ、培养时间６ ｄ；最适发酵培养基为４．０％蔗糖、０．７０％酵母粉、０．１５％ Ｋ２ＨＰＯ４和０．１０％ ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ。在此条件下，菌丝体干重为６．８８０ ｇ／Ｌ，胞外多糖产量为０．８６１ ｇ／Ｌ。
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关键词 ：武陵山羊肚菌（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）；液体培养；菌丝体；胞外多糖
中图分类号：Ｑ９４９．３２ 文献标识码：Ａ 文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）０２－０４０５－０４
ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．０２．０３７
羊肚菌（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）是一种营养丰富、美味可口的珍贵食药用菌，其性平、味甘，益肠胃、化痰理气，补肾、壮阳，补脑、提神，具有增强肌体免疫力、抗疲劳、抗衰老、降血脂、抗病毒和抑制肿瘤等功能［１，２］。虽然国内外已有一些羊肚菌人工栽培的报道，但由于其对气候、土壤等环境条件要求苛刻，至今仍未实现规模化栽培［３－６］。自然资源很少，远不能满足市场需求。为此，笔者分离重庆武陵山羊肚菌，并对其液体培养条件进行了优化，拟为其人工栽培、食品和药品开发提供依据。
１ 材料与方法
１．１ 材料
菌种：武陵山羊肚菌，长江师范学院生物技术实验室分离保存。
母种ＰＤＡ培养基：２０％马铃薯（去皮）煮汁，２．０％葡萄糖，０．３０％蛋白胨，１．８％琼脂，０．１０％ Ｋ２ＨＰＯ４，０．０５％ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，ｐＨ自然［７］。
液体种子培养基：１０％马铃薯煮汁，２．０％葡萄糖，０．５０％蛋白胨，０．１０％Ｋ２ＨＰＯ４，０．０５％ＭｇＳＯ４，ｐＨ ６．０［８］。
发酵培养基：４．０％葡萄糖，０．５０％蛋白胨，０．１０％Ｋ２ＨＰＯ４，０．０５％ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，ｐＨ ６．０。
１．２ 方法
１．２．１ 菌种活化 把保藏的羊肚菌母种转接到无菌ＰＤＡ培养基平皿上，２５ ℃培养７ ｄ，备用。
１．２．２ 液体培养方法 将种子培养液装入２５０ ｍＬ锥形瓶中，每瓶１００ ｍＬ，０．１０ ＭＰａ、１２１．３ ℃灭菌２０ ｍｉｎ，冷却，接羊肚菌母种于锥形瓶中，１６０ ｒ／ｍｉｎ、２５ ℃培养３ ｄ备用［９］。发酵培养液装量同种子培养液，培养条件相同，培养时间６ ｄ。
１．２．３ 发酵培养基选择 选取蔗糖、酵母粉、Ｋ２ＨＰＯ４、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ４个因素，设计Ｌ９（３４）正交试验，因素与水平见表１。通过试验，筛选最佳培养基配方。
１．２．４ 菌丝体干重测定 取发酵液３０ ｍＬ，在４ ０００ ｒ/ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，沉淀菌丝体用去离子水洗涤３次，于７０ ℃下烘干至恒重，称重，每个处理重复３次。
１．２．５ 羊肚菌胞外多糖测定 参照武秋立等［１０］的方法，取出菌丝体羊肚菌发酵液加入３倍乙醇于０ ℃下沉淀１２ ｈ，于４ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ；弃上清液，沉淀加少量乙醇再离心，重复两次后，将沉淀用去离子水溶解定容，用硫酸－蒽酮法于６２０ ｎｍ处测吸光度，根据硫酸－蒽酮葡萄糖标准曲线计算胞外多糖产量。
１．２．６ 数据处理 试验数据用ＤＰＳ ７．０５版软件处理，用ＬＳＤ法比较菌丝体干重和多糖的差异显著性。
２ 结果与分析
２．１ 液体培养条件选择
２．１．１ ｐＨ对菌丝体干重和多糖产量的影响 用２．０ ｍｏｌ/Ｌ HCl或氢氧化钠溶液调节培养液ｐＨ分别为４．０、５．０、６．０、７．０、８．０，接种培养（表２）。当ｐＨ ６．０时，菌丝体生长最快，其干重和胞外多糖产量均最高； ｐＨ ６．０与ｐＨ ７．０菌丝体干重之间差异不显著，而ｐＨ ６．０与ｐＨ ５．０胞外多糖产量之间差异极显著；当ｐＨ ４．０时，菌丝体干重及多糖产量均最低。可见，菌丝体生长、多糖形成的最适ｐＨ为６．０。
２．１．２ 培养液装量对菌丝体干重和多糖产量的影响 250 mL三角瓶分别装６０、８０、１００、１２０、１４０ ｍＬ培养液（表３）。当培养液装量为１００ ｍＬ时，菌丝体干重、多糖产量均最高；当装量为１４０ ｍＬ时菌丝体干重、多糖产量均最低。因此，最适装量为１００ ｍＬ。
２．１．３ 接种量对菌丝体干重和多糖产量的影响 培养液接种量分别为４％、８％、１２％、１６％、２０％（表４）。当接种量８％时，菌丝体干重、多糖产量均最高；接种量８％与１２％菌丝体干重、多糖产量之间均差异极显著；接种量２０％时，菌丝体干重、多糖产量均最低。可见，最适接种量是８％。
２．１．４ 温度对菌丝体干重和多糖产量的影响 培养温度分别为２１、２３、２５、２７、２９ ℃（表５）。在２５ ℃时，菌丝体干重、多糖产量均最高；在２１℃时，菌丝体干重、多糖产量均最低。可见，最适培养温度是２５ ℃。
２．１．５ 转速对菌丝体干重和多糖产量的影响 将培养液置于摇床上振荡培养，转速分别设置为１４０、１６０、１８０、２００、２２０ ｒ／ｍｉｎ（表６）。当转速为１８０ ｒ／ｍｉｎ时，菌丝体干重最重，１８０、２００ ｒ／ｍｉｎ菌丝体干重之间差异显著；当转速为２００ ｒ／ｍｉｎ时，多糖产量最高；而２００、１８０ ｒ／ｍｉｎ多糖产量之间差异不显著。因此，最适转速为１８０ ｒ／ｍｉｎ。
２．１．６ 培养时间对菌丝体干重和多糖产量的影响 培养液分别培养４、５、６、７、８ ｄ（表７）。当培养６ ｄ时菌丝体干重最重，培养６ ｄ与７ ｄ菌丝体干重之间差异极显著；培养８ ｄ时多糖产量最高，培养８ ｄ与７ ｄ多糖产量之间差异不显著，而培养７ ｄ与６ ｄ多糖产量之间有极显著差异。因此，最适培养时间为６ ｄ。
２．２ 发酵培养基选择
２．２．１ 碳源对菌丝体干重和多糖产量的影响 分别用４．０％可溶性淀粉、蔗糖、甘露醇和麦芽糖代替发酵培养基中的葡萄糖为碳源（表８）。结果菌丝体干重在蔗糖培养基中最重，在可溶性淀粉培养基中最轻；多糖产量在可溶性淀粉培养基中最高，在麦芽糖培养基中最低。综合菌丝体干重和多糖产量，选蔗糖为最适碳源。
２．２．２ 氮源对菌丝体干重和多糖产量的影响 分别用０．５０％牛肉膏、酵母粉、硫酸铵和尿素代替发酵培养基中的蛋白胨（表９）。菌丝体干重、多糖产量在酵母粉培养基中均最高，二者在尿素培养基中均最低。因此，酵母粉是最适氮源。
２．２．３ 无机盐对菌丝体干重和多糖产量的影响 分别用０．１０％ Ｋ２ＨＰＯ４、ＣａＳＯ４·０．５Ｈ２Ｏ、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ、ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ、ＺｎＳＯ４·７Ｈ２Ｏ代替发酵培养基中的Ｋ２ＨＰＯ４和ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ（表１０）。在只有Ｋ２ＨＰＯ４培养基中菌丝体干重、多糖产量均最高，但在Ｋ２ＨＰＯ４与ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ培养基中菌丝体干重、多糖产量之间差异不显著；在ＺｎＳＯ４·７Ｈ２Ｏ培养基中菌丝体干重、多糖产量均最低。因此，最适无机盐是Ｋ２ＨＰＯ４。
２．２．４ 正交试验结果 由表１１可知，以菌丝体为指标的培养基最优配方为Ａ２Ｂ３Ｃ３Ｄ２；以多糖为指标的培养基最优配方为Ａ２Ｃ３Ｄ3Ｂ2；两者结合并合并主次顺序选Ａ２Ｂ３Ｃ３Ｄ２，即４．０％蔗糖、０．７０％酵母粉、０．１５％ Ｋ２ＨＰＯ４、０．１０％ ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ。但该培养基配方不在正交试验列表中，用该培养基配方进行验证试验，结果菌丝体干重为６．８８０ ｇ/Ｌ，胞外多糖为０．８６１ ｇ/Ｌ。
３ 小结
武陵山羊肚菌的最适液体培养条件为ｐＨ ６．０、２５０ ｍＬ锥形瓶培养液装量为１００ ｍＬ、接种量８％、温度２５ ℃、摇床转速１８０ ｒ／ｍｉｎ，培养时间６ ｄ。最适液体发酵培养基为４．０％蔗糖、０．７０％酵母粉、０．１５％ Ｋ２ＨＰＯ４、０．１０％ ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ。在此优化条件下，菌丝体干重为６．８８０ ｇ／Ｌ，多糖产量为０．８６１ ｇ／Ｌ，菌丝体干重、胞外多糖产量分别比正交试验表中的最优配方Ａ２Ｂ３Ｃ１Ｄ２高９．７１％和１９．０９％。
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参考文献：
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（责任编辑 龙小玲）
