李 晶
南阳理工学院 河南省南阳市 473004
【摘 要】目的：分析研究三种药用植物内生细菌的多样性。方法：选择生长在强辐射且温度波动大、海拔高环境下的党参、连翘、黄芪这三种青藏高原移栽药用植物作为本次研究的对象，通过分子生物学技术及分离培养方法等手段，对上述三种药用植物内生细菌的状态、遗传多样性等方面内容加以研究。结果：连翘、黄芪及党参这三种药用植物中，皆存在内生细菌且菌群类型非常丰富；其内生细菌由HGC、β-proteobacteria、CFB、厚壁菌门组成；具有耐盐性，且存在对抗生素的抗药性。结论：本次研究结论有利于更清楚、全面的认知在极端环境下，植物内生细菌的生理特性、菌群结构，可丰富青藏高原药用植物内生细菌资源。
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关键词 党参；黄芪；连翘；生细菌；多样性
青藏高原太阳辐射较强、氧气不充足，由于受到低温及干旱的天气影响，动植物在这里很难生长。本次研究的党参、黄芪、连翘三种植物均喜凉爽气候，抗旱、抗旱能力较强，其地下根系发达，可有效固土、防风。随着人们对药用植物需求量的逐渐扩大，发展人工种植药用植物也变得重要起来。虽然就药用植物的栽培技术与育种等方面来说有了很多研究结果，但在与微生物及药用植物间的研究却相当匮乏 [1]。本次研究通过微生物、分子生物学手段，对三种药用植物内生细菌的多样性进行研究。
1 资料与方法
（1）植物选择。试验所用党参、黄芪、连翘，均未见有病害症状，无冲孔，根际土应同时带回。
（2）内生菌的分离、纯化。分别取黄芪、党参及连翘三者1g 植物叶片，做无菌水冲洗处理，并使用滤纸将水分完全吸净；依次再做如下处理：持续30s~1min 的70%酒精表面消毒，无菌水冲洗处理；8 分钟~10 分钟的1‰升汞浸泡，做彻底消毒处理，并无菌水冲洗；取200ul（最后一次冲洗叶片）的无菌水，涂抹在LB 固体培养基平板上，并在28℃的外部条件下，持续培养3d，最后检测表面灭菌效果。
对已经做好了表面灭菌处理的植物叶片进行研磨，并借助于逐级稀释法，将其稀释到浓度保持在105 倍，在LB 培养基上，涂布200ul 不同稀释浓度的匀浆液。浓度不同做三次重复，在外界温度为28℃的条件下，培养时间持续2 天；记录每个平板上菌落的数量，同时依据菌落的大小、颜色以及形状等形态内容，选择存在差异的菌落，将其放于相同的培养基平板之上，进行纯化培养；将纯化培养之后的细菌接种与相对应培养基的斜面上，于4℃的条件下保存。
（3）内生细菌16SrDNA 序列测定、同源性对比。做16SrDNA 基因测序时，选取有典型RFLP 带型的菌株，序列长度设定为1500bp，对比采用BLAST，最终确定伴有较高同源性的16SrDNA 序列；应用CLUST-ALX 做序列对比。
（4）适合PH 值的测定[2]。取培养至对数生长期的各菌原液共100ul，将其加入到PH 值分别为4.0、5.0 依次直至11.0 的5lLB 液体培养基中，在28℃条件下，经过持续24h 的培养之后，观察细菌生长情况。
（5）耐盐性。取培养至对数生长期的各菌原液共100ul，将其加入到NaCL 浓度分别在5%、7%、9%、11% 的5ml LB 液体培养基中，培养1 天后，对其浑浊度进行观察。
（6）抗药性。取四环素、利福平、卡那霉素、链霉素、羧苄青霉素、庆大霉素的抗生物纸片，取200ul 培养至对数期的菌液加入到LB 固体培养基中均匀涂布，将抗生素纸片放入其中，于28℃条件下培养72h，观察菌株生长情况。
2 结果
（1）内生细菌分离的结果。经分离结果表明，培养基中生长出了大量形态各异的菌落。这也说明，黄芪、党参、连翘这三种药用植物的叶片组织不仅存在大量内生细菌，而且其内生细菌的类群十分丰富。分离共获得42 株内生细菌。依据其不尽相同的形态加以归类。在分离出的内生细菌中，存在有83.3% 的菌株可产橘红、肉红以及黄色色素。
（2）内生细菌遗传多样性。三种药用植物分离出的内生细菌具有较近的亲缘关系；内生细菌可分为四大类群，即包括HGC（高G+C 含量的革兰氏阳性细菌）、β-proteobacteria、CFB（黄杆菌/ 嗜纤维菌/ 拟杆菌群）、厚壁菌门（Firmicutes），种属类型丰富。
（3）适宜PH 值。三种药用植物内生细菌均不适宜在较强酸性的环境下生长，在PH 值为7.0~9.0 的中性偏碱性环境下可获得较好长势。
（4）耐盐性。本次研究中各菌株在NaCL浓度为0%~8%的培养基中均可成长，说明菌株耐盐性极强，均为耐盐菌。
（5）抗药性。党参、黄芪、连翘三种内生物细菌皆存在对抗生素的抗药性，可丰富其生物学作用。
3 讨论
本次研究对黄芪、连翘及党参这三种青藏高原药用植物内生细菌做了一些研究，在借助于各项检测手段的基础上，分析了植物内生细菌与环境的关系，就其本质来说，属于对所处环境的适应性。这也在一定程度上给我们开辟了新思路去认识植物内生细菌，还需深入进行探索。
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参考文献
[1] 方晓梅, 张玉琴, 魏玉珍等. 药用植物内生细菌的多样性及其抗HIV 活性次级代谢产物的初步筛选[C]. 第四届全国微生物资源学术暨国家微生物资源平台运行服务研讨会论文集,2012:110-111.
[2] 毕江涛, 杨薇, 李萍等. 濒危药用植物沙冬青内生细菌分离及其抑菌活性初步分析[J]. 天然产物研究与开发,2013,25(12):1621-1626+1652.
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